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ウイルスに特異的な複製マシーナリーの構造基盤の解明と創薬への応用

研究課題

研究課題/領域番号 11J06792
研究種目

特別研究員奨励費

配分区分補助金
応募区分国内
研究分野 構造生物化学
研究機関東京大学

研究代表者

小林 幹  東京大学, 大学院理学系研究科, 特別研究員(DC1)

研究期間 (年度) 2011 – 2013
研究課題ステータス 完了 (2013年度)
配分額 *注記
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
2013年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2012年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2011年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
キーワードウイルスタンパク質 / 組み換えバキュロウイルス / DNA複製 / ヘルペスウイルス
研究概要

本年度はウマヘルペスウイルス由来のヘリカーゼ・プライマーゼ複合体の結晶化試料の調製に取り組んだ。前年度に作製したヘリカーゼ、プライマーゼそれぞれの遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを昆虫細胞Sf+に感染させることでヘリカーゼ・プライマーゼ複合体を発現させた。この中でも特にウマヘルペスウイルスに関しては他の2種と比べて比較的発現状況が良好であるが結晶化に持ち込むほどの量のタンパク質が得られないことが前年度の研究によりわかっていた。そこで発現条件の検討を行った。具体的には昆虫細胞Sf+に感染させるバキュロウイルス濃度の検討や感染時間の検討などを行ったが、発現量を改善することはできなかった。またウマヘルペスウイルスのヘリカーゼは単体で大量に発現することが前年度の実験で分かっていたため、ヘリカーゼ単体についても構造決定に取り組んだ。前年度の実験により全長のウマヘルペスウイルス由来ヘリカーゼは大量発現と高純度精製はできるものの結晶化しないことが分かっていた。そこで今年度は末端領域を削ったヘリカーゼのコンストラクトを作製し、その遺伝子を含むバキュロウイルスを作製して同様に昆虫細胞Sf+に感染させた。そして感染した昆虫細胞を用いてウェスタンブロットを行ったが、ヘリカーゼの発現を確認することはできなかった。また今年度はインフルエンザウイルスが宿主に感染する際に用いるタンパク質であるヘマグルチニンの細胞外ドメインの調製にも取り組んだ。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの遺伝子に細胞外分泌シグナル配列とヒスチジンタグの遣伝子を融合させた遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞に感染させた。そして分泌タンパク質を含む培養上清からNiカラムを用いてヘマグルチニンを精製したところタンパク質の発現が確認された。今後大量発現と精製を行い、薬剤との共結晶化を行う。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究は本年度が最終年度である。ヘルペスウイルスのヘリカーゼ・プライマーゼ複合体は結晶化に必要な量のタンパク質を調製する系が構築できていない。一方インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンの細胞外ドメインは発現に成功したため今後結晶化に十分な量のタンパク質を調整し、薬剤との共結晶化を行う。

今後の研究の推進方策

本研究は本年度が最終年度である。ヘルペスウイルスのヘリカーゼ・プライマーゼ複合体はタンパク質の発現量の低さが問題となっている。今後はタンパク質のコンストラクトやタンパク質の発現条件を検討することで発現量の向上を試みる予定である。また宿主となる昆虫細胞の種類を検討することも行う。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに関しては、ヘマグルチニンを高純度で精製する系を確立するとともに薬剤との共結晶化を行い、複合体の構造を決定する。

報告書

(3件)
  • 2013 実績報告書
  • 2012 実績報告書
  • 2011 実績報告書
  • 研究成果

    (13件)

すべて 2013 2012 2011

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (10件)

  • [雑誌論文] Recent structural studies on Dom34/aPelota and Hbs1/aEF1α : important factors for solving general problems of ribosomal stall in translation2013

    • 著者名/発表者名
      Kan Kobayashi, Ryuichiro Ishitani, and Osamu Nureki
    • 雑誌名

      Biophysics

      巻: 9 ページ: 131-140

    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Structural basis for translation termination by archaeal RF1 and GTP-bound EF1α complex.2012

    • 著者名/発表者名
      Kan Kobayashi, Kazuki Saito, Ryuichiro Ishitani, Koichi Ito, Osamu Nureki
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Res.

      巻: 40 号: 18 ページ: 9319-9328

    • DOI

      10.1093/nar/gks660

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] 古細菌由来Pelota・EF1α・GTP複合体によるmRNA品質管理機構の構造基盤2012

    • 著者名/発表者名
      小林幹, 石谷隆一郎, 濡木理
    • 雑誌名

      生物物理

      巻: 52 ページ: 182-185

    • NAID

      10030494636

    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal RF1 and GTP-bound EF1A complex.2013

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      aaRS2013
    • 発表場所
      神奈川, プリンス箱根
    • 年月日
      2013-10-08
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal aRF1 and GTP-bound EF1α complex.2013

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      第15回日本RNA学会年会
    • 発表場所
      愛媛, ひめぎんホール
    • 年月日
      2013-07-26
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal RF1 and GTP-bound EF1A complex.2013

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      RNA 2013
    • 発表場所
      Davos, Switzerland
    • 年月日
      2013-06-14
    • 関連する報告書
      2013 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal RF1 and GTP-bound EF1α complex.2012

    • 著者名/発表者名
      Kan Kobayashi
    • 学会等名
      XXIV tRNA Conference
    • 発表場所
      オルムエ(チリ)
    • 年月日
      2012-12-04
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] 古細菌由来aRF1・EF1α・GTP複合体による翻訳終結機構の構造基盤2012

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      RNAフロンティアミーティング2012
    • 発表場所
      メルパルクKUMAMOTO(熊本)
    • 年月日
      2012-09-20
    • 関連する報告書
      2012 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal aRF1 and GTP-bound EF1α complex2011

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      第34回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川)
    • 年月日
      2011-12-14
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal aRF1 and GTP-bound EF1α complex2011

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      The 2011 International Symposium on Aminoacyl-tRNA Synthetases
    • 発表場所
      Snow Bird (Salt Lake City, USA)
    • 年月日
      2011-09-26
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] 古細菌由来Pelota-EF1α-GTP複合体によるmRNA品質管理機構の構造基盤2011

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      RNAフロンティアミーティング2011
    • 発表場所
      あいち健康プラザ(愛知)
    • 年月日
      2011-08-30
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] Structural basis for translation termination by archaeal aRF1 and GTP-bound EF1α complex2011

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      RNA2011
    • 発表場所
      京都国際会議場(京都)
    • 年月日
      2011-06-11
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書
  • [学会発表] 古細菌由来Pelota-EF1α-GTP複合体によるmRNA品質管理機構の構造基盤2011

    • 著者名/発表者名
      小林幹
    • 学会等名
      第11回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪)
    • 年月日
      2011-06-08
    • 関連する報告書
      2011 実績報告書

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公開日: 2011-12-12   更新日: 2024-03-26  

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