研究課題
特別研究員奨励費
生物時計は、昼夜の変化に適応するために、様々な活性を24時間周期で自律的に振動させる細胞内分子機構である。藍色細菌の生物時計はKaiA、KaiB、KaiCからなっており、ATP存在下においてこれらの3つのタンパク質が相互に作用しあうことで自律的な時間振動を生み出すことができる。KaiBは進化の初期では2量体であり、藍色細菌において時計として進化した結果、4量体を形成するようになったのだと考えられる。4量体構造と機能の関わりを検証するために、C末端酸性残基(95-108)を欠失させた変異体KaiB、KaB_<1-94>を作製した。KaiB_<1-94>は2量体と見積もられた。KaiB_<1-94>はin vitroで野生型と同様にリズム発振する機能があることが示された。原子間力顕微鏡(AFM)を用いた解析によって、KaiB_<WT>のオリゴマー構造を検証した。AFM解析は、鋭い探針によって試料表面を走査し上下方向への変位を計測することにより、試料表面の凹凸形状の評価を行う手法である。この結果、KaiB_<WT>では3つのタイプの粒子が観察された。この結果は、KaiB_<WT>が4量体-2量体-単量体の平衡状態にある可能性を示唆する。この結果およびKaiB_<1-94>がin vitroでリズムを発振できるという結果を踏まえると、2量体もしくは単量体構造のKaiB<WT>がKaiCと複合体を形成するのではないかというモデルが示唆された。また、蛍光相関分光法(FCS法)により、時間振動中のKaiAとKaiBの複合体形成を詳細に調べた。KaiAとKaiBはともに、KaiCのリン酸化状態によってKaiCの結合親和性が変わり、異なる複合体形成の位相を示すことが明らかになった。
3: やや遅れている
育児のため短時間勤務をしており、研究の進捗はややゆるやかなものになっている。しかし、KaiB_<WT>が異なるオリゴマー構造をとっていることをAFM解析によって示し、また、時間振動中のKaiA-KaiC複合体形成およびKaiB-KaiC複合体形成の時間振動をFCS法により明らかにするなど、新しい知見を得ている。
KaiBのオリゴマー構造がKaiB-KaiC複合体形成にどのように関わるか、また、SasA-KaiC複合体形成をどのように阻害するかを明らかにするため、X線結晶構造解析やNMR解析等によって、KaiB-KaiC複合体およびSasA-KaiC複合体の構造解析を進める。平成25年度に古細菌型Kaicの精製条件の検討を進めてきたので、精製手法の確立および古細菌型KaiB-Kaic複合体の機能の検討を行う。
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