| 研究課題/領域番号 |
12033219
|
|---|
| 研究種目 |
特定領域研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究機関 | 岡山理科大学 |
|---|
研究代表者 |
西河 淳 岡山理科大学, 理学部, 助教授 (30218127)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2000
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
|
| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2000年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
|
|---|
| キーワード | マンノース6リン酸 / N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ / 細胞内輸送 |
|---|
| 研究概要 |
種々の細胞において新しく生合成された酸性加水分解酵素は、N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ(GPT)の作用により、リソソーム輸送タグとなるマンノース6リン酸残基が付加される。そして、これがマンノース6リン酸結合タンパク質にトラップされ細胞内のリソソームに輸送される。この機構において、GPTの糖鎖に対する基質特異性は以前より生成物であるリソソームタンパク質の糖鎖構造解析の結果より推定されていた。しかし、それらはリソソームへ輸送中、或いはリソソーム内において糖鎖の修飾を既に受けている可能性があり、GPT本来の基質特異性とは異なっている可能性がある。そこで、我々は、精製したGPTと蛍光標識した各種糖鎖を用いてin vitroの系でGPTの基質特異性を検討した。
我々は、まずウシ膵臓ミクロソーム分画よりイオン交換、金属キレートおよびConAクロマトグラフィーなどによりGPTを精製した。これと2-アミノピリジル化した様々な高マンノース型糖鎖を基質として反応させ、得られた生成物を逆相および順相カラムで分離し、TOF-MS、弱酸加水分解、グリコシダーゼ消化などにより生成物の構造を推定した。
その結果、高マンノース型糖鎖の1-6鎖非還元末端に位置するマンノース残基に最も良くN-アセチルグルコサミン-1-リン酸が付加され、次に1-3鎖の非還元末端から一つ内側のマンノース残基に良く付加されることが判明した。また、グルコースが一残基ついた付いたGlcMan9GlcNAc2にもGPTが反応し、2カ所のN-アセチルグルコサミン-1-リン酸付加サイトの存在が判明した。
|
