| 研究課題/領域番号 |
12035227
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| 研究種目 |
特定領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
間 陽子 理化学研究所, 分子細胞生物学研究室, 先任研究員 (50182994)
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| 研究分担者 |
蒲田 政和 理化学研究所, 分子細胞生物学研究室, 基礎科学特別研究員 (00291063)
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| 研究期間 (年度) |
2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
2000年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | HIV-1 vpr / G2期arrest / アポトーシス / 核移行 / Vpr結合因子 / yeast two-hybrid法 / Importin a,b / HHR23A |
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| 研究概要 |
HIV-1vpr遺伝子産物のG2期arrest、アポトーシス、核移行、さらには細胞内因子との相互作用に関与するドメインを同定すると同時に、Vpr蛋白と特異的に相互作用する細胞内蛋白の単離を試みた。
1.強いアポトーシス活性を持つVpr蛋白のC末端欠失変異体の解析
G2期arrest能を完全に消失しているが、G1期arrest能と強いアポトーシス活性を獲得したVpr蛋白のC末端欠失変異体を見いだし、G2期arrestとアポトーシスは異なる経路で発揮される可能性を示した。同様に、野生型VprもG2期arrestとは異なる機序によるアポトーシス誘導能を有する事を明らかにした。これら一連の成果は細胞内に発現させたVpr蛋白が細胞をG2期arrestとは異なる経路でアポトーシス出来るという最初の報告である。
2.yeast two-hybrid法によるHIV-1 Vpr結合因子の検索
野生型Vprと同様の発現能、核膜・核への局在能を保持しているが細胞増殖抑制能を完全に消失している、Vpr17-81変異体をbaitとして、yeast two-hybrid法を行った。UNG、HHR23Aを含む5種類の既知の蛋白質と、6種類の未知の蛋白質をコードする遺伝子が同定された。この中で、HHR23Aについては、C末端側UBAドメインがVprとの結合に重要である事、さらに、この結合にはVprの二つのa-Helixドメイン内の33位のHis、67位のLeu及び74位のIleの各アミノ酸が重要であることを証明した。現在、その他のクローンについても解析を進めている。
3.Vpr蛋白とImportin a,bとの相互作用の解析
Vpr蛋白の核局在化には、核移行シグナルとして機能しうる2つのa-helixドメインが共に重要であることを明らかにした。In vitro translationで作製した野性型および変異型Vpr蛋白を用いてpull-down assayを行った結果、GST融合型Importin a及びbはVpr蛋白の2つ目のa-helixドメインと相互作用している事が示された。さらに、Digitonin処理をしたHeLA細胞を用いたNuclear import assayにより、Vprの2つ目のa-helixドメインは核内への移行に、1つ目のa-helixドメインは核膜局在に重要であることを明らかにした。
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