ヌクレオチド除去修復による遺伝情報維持と細胞機能制御機構

• 研究課題/領域番号: 12143207
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 菅澤 薫 独立行政法人理化学研究所, 花岡細胞生理学研究室, 副主任研究員 (70202124)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 35,200千円 (直接経費: 35,200千円); 2004年度: 8,700千円 (直接経費: 8,700千円); 2003年度: 8,700千円 (直接経費: 8,700千円); 2002年度: 8,800千円 (直接経費: 8,800千円); 2001年度: 9,000千円 (直接経費: 9,000千円)
• キーワード: ヌクレオチド除去修復 / XPCタンパク質 / UV-DDB / ユビキチン化 / centrin 2 / 色素性乾皮症 / RAD23ホモログ / ユビキチン / プロテアソーム / DDB / DNA損傷認識 / XPC-HR23B複合体 / 塩基除去修復 / チミンDNAグリコシラーゼ / DNA損傷 / DNA損傷認識機構 / ピリミジン二量体 / コビキチン化

研究概要

細胞の紫外線照射に伴い、C群色素性乾皮症(XPC)タンパク質がUV-DDB依存的にユビキチン化されることを昨年までに明らかにした。細胞抽出液からの共免疫沈降実験、および精製タンパク質を用いたin vitroでの結合実験から、XPCとUV-DDBが直接物理的に相互作用することが示された。また、DDB1、DDB2に加えてcullin 4A、Roc1を昆虫細胞で同時に発現させることにより、ユビキチン・リガーゼ活性を持つUV-DDB-E3複合体を精製し、これを用いてXPCのユビキチン化反応を無細胞系で再構成することに成功した。この反応系ではXPCだけでなく、DDB2とcullin 4Aもユビキチン化の基質となるが、紫外線照射した細胞ではXPCのユビキチン化が可逆的であるのに対して、DDB2は速やかに分解されることがわかった。すなわち、XPCとDDB2は共通のE3によってユビキチン化されるにもかかわらず、その細胞内での運命が大きく異なることが明らかになった。
一方、XPCと複合体を形成するcentrin 2の機能を解析するため、まずXPCにおけるcebtrin 2結合領域を同定した。この結合領域に3か所のアミノ酸置換を導入することによってcentrin 2との結合能を欠く変異XPCを作成した。この変異XPCは細胞内、および無細胞系において、野生型XPCと比較してヌクレオチド除去修復における活性が有意に低下していた。精製タンパク質を用いた生化学的な解析により、centrin 2は複合体形成を介してXPCの損傷DNA結合活性を増強し、それによって修復反応を促進することが示された。

研究成果

• [雑誌論文] Nucleosomal structure of undamaged DNA regions suppresses the non-specific DNA binding of the XPC complex (2005)
  • 著者名/発表者名: Yasuda, T. et al.
  • 雑誌名: DNA Repair 4(3) ページ: 389-395
• [雑誌論文] Nucleotide excision repair of 5-formyluracil in vitro is enhanced by the presence of mismatched bases (2004)
  • 著者名/発表者名: Kino, K. et al.
  • 雑誌名: Biochemistry 43(10) ページ: 2682-2687
• [雑誌論文] Overproduction of eukaryotic SUMO-1- and SUMO-2-conjugated proteins in Escherichia coli (2004)
  • 著者名/発表者名: Uchimura, Y. et al.
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 331(1) ページ: 204-206
• [雑誌論文] Relative levels of the two mammalian Rad23 homologs determine composition and stability of the xeroderma pigmentosum group C protein complex (2004)
  • 著者名/発表者名: Okuda, Y. et al.
  • 雑誌名: DNA Repair 3(10) ページ: 1285-1295
• [文献書誌] Janicijevic, A.et al.: "DNA bending by the human damage recognition complex XPC-HR23B."DNA Repair. 2. 325-336 (2003)
• [文献書誌] Ng, J.M.Y.et al.: "A novel regulation mechanism of DNA repair by damage-induced and RAD23-dependent stabilization of xeroderma pigmentosum group C protein."Genes and Development. 17. 1630-1645 (2003)
• [文献書誌] Fujiwara, K.et al.: "Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B."Journal of Biological Chemistry. 279. 4760-4767 (2004)
• [文献書誌] Araki, M., et al.: "Reconstitution of damage DNA excision reaction from SV40 minichromosomes with purified nucleotide excision repair proteins"Mutation Research. 459. 147-160 (2002)
• [文献書誌] Yokoi, M., et al.: "The xeroderma pigmentosum group C protein complex XPC-HR23B plays an important role in the recruitment of transcription factor IIH to damaged DNA"Journal of Biological Chemistry. 275. 9870-9875 (2000)
• [文献書誌] Yamane K., et al.: "Retinoblastoma susceptibility protein, Rb, possesses multiple BRCT-Ws, BRCA1 carboxyl-terminus-related W regions with DNA break-binding activity"Oncogene. 19. 1982-1991 (2000)
• [文献書誌] Winkler.G.S., et al.: "Novel functional interactions between nucleotide excision DNA repair proteins influencing the enzymatic activities of TFIIH, XPG, and ERCC1-XPF"Biochemistry. 40. 160-165 (2001)
• [文献書誌] Sugasawa, K., et al.: "A multistep damage recognition mechanism for global genomic nucleotide excision repair"Genes and Development. 15. 507-521 (2001)
• [文献書誌] Kusumoto, R., et al.: "Diversity of the damage recognition step in the global genomic nucleotide excision repair in vitro"Mutation Research. 485. 219-227 (2001)
• [文献書誌] Araki, M., et al.: "Centrosome protein centrin 2/caltractin 1 is part of the xeroderma pigmentosum group C complex that initiates global genome nucleotide excision repair"Journal of Biological Chemistry. 276. 18665-18672 (2001)
• [文献書誌] Sugasawa, K., et al.: "A molecular mechanism for DNA damage recognition by the xeroderma pigmentosum group C protein complex"DNA Repair. 1. 95-107 (2002)
• [文献書誌] Ng, J.M.Y., et al.: "Developmental defects and male sterility in mice lacking the ubiquitin-like DNA repair gene mHR23B"Molecular and Cellular Biology. 22. 1233-1245 (2002)
• [文献書誌] Hey, T., et al.: "The XPC-HR23B complex displays high affinity and specificity for damaged DNA in a true-equilibrium fluorescence assay"Biochemistry. 41. 6583-6587 (2002)
• [文献書誌] Uchida, A., et al.: "The carboxy-terminal domain of the XPC protein plays a crucial role in nucleotide excision repair through interactions with transcription factor IIH"DNA Repair. 1. 449-461 (2002)
• [文献書誌] Shimizu, Y., et al.: "Xeroderma pigmentosum group C protein interacts physically and functionally with thymine DNA glycosylase"EMBO Journal. 22. 164-173 (2003)
• [文献書誌] Janicijevic, A., et al.: "DNA bending by the human damage recognition complex XPC-HR23B"DNA Repair. 2(in press). (2003)
• [文献書誌] Kusumoto, R. et al.: "Diversity of the damage recognition step in the global genomic nucleotide excision repair in vitro"Mutation Research. 485. 219-227 (2001)
• [文献書誌] Araki, M. et al.: "Centrosome protein centrin 2/caltractin 1 is part of the xeroderma pigmentosum group C protein complex that initiates global genome nucleotide excision repair"Journal of Biological Chemistry. 276. 18665-18672 (2001)
• [文献書誌] Sugasawa, K. et al.: "A molecular mechanism of DNA damage recognition by the xeroderma pigmentosum group C protein complex"DNA Repair. 1. 95-107 (2002)
• [文献書誌] Ng, J. M. Y. et al.: "Developmental defects and male sterility in mice lacking the ubiquitin-like DNA repair gene mHR23B"Molecular and Cellular Biology. 22. 1233-1245 (2002)
• [文献書誌] Sugasawa,K. et al.: "A multistep damage recognition mechanism for global genomic nucleotide excision repair"Genes & Development. 15(in press). (2001)
• [文献書誌] Kusumoto,R. et al.: "Diversity of the damage recognition step in the global genomic nucleotide excision repair in vitro"Mutation Research. (in press). (2001)
• [文献書誌] Winkler,G.S. et al.: "Novel functional interactions between nucleotide excision DNA repair proteins influencing the exzymatic activities of TFIIH,XPG, and ERCC1-XPF"Biochemistry. 40. 160-165 (2001)
• [文献書誌] Yamane,K. et al.: "Retinoblastoma susceptibility protein,Rb, possesses multiple BRCT-Ws, BRCA1 carboxyl-terminus-related W regions with DNA break-binding activity"Oncogene. 19. 1982-1991 (2000)