| 研究概要 |
本研究では,線虫C.elegansの生理活性ペプチドの効率的な抽出法の確立と単離を行い,その一部についてアミノ酸配列決定を行った。
【線虫の大量調製】プレート法および液体培養法により線虫C.elegansの幼虫および成虫を約100g調製した。
【ペプチド画分の精製】線虫を液体窒素中で粉砕し,冷アセトンで脱脂後,80%エタノールで低分子ペプチドを抽出した。さらに,2%食塩水を用いて残さより高分子ペプチドを抽出した。それぞれのペプチド画分を熱処理してタンパク分解酵素を失活させ,イオン交換樹脂を用いて中性,酸性,塩基性画分に大別した。さらに,酸性および塩基性画分についてはイオン強度によりペプチドを細分化した。それぞれの画分について逆相HPLCで分析した結果,良好な分離パターンが得られた。よって,上記の方法により,ペプチドを迅速に単離できると考えられる。さらに,幼虫期および成虫期由来のペプチドでは分離パターンが著しく異なることから,発育段階別にペプチド精製を行うことが極めて有効であると考えられる。
【ペプチドの単離】逆相HPLC分析で比較的単離し易いと思われる20種のペプチドについて,イオン交換および逆相HPLCを組み合わせることにより,精製単離した。現在,さらなるペプチドの単離操作を行っている。
【アミノ酸配列決定】単離したペプチドの分子量をESI-TOF-MSを用いて測定した。次いで,アミノ酸配列分析を行った。アミノ酸配列が得られたペプチドについて,部分配列,分子量をもとに線虫のデータベース検索を行うことにより,全一次配列を決定した。N末端修飾によりアミノ酸配列が得られなかったペプチドについては,MS-MSによる配列決定を行っている。
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