蛋白質―蛋白質相互作用情報の系統的解析

• 研究課題/領域番号: 12206004
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 伊藤 隆司 金沢大学, がん研究所, 教授 (90201326)
• 研究分担者: 住本 英樹 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (30179303) ; 太田 一寿 金沢大学, がん研究所, 助手 (00322727)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 46,000千円 (直接経費: 46,000千円); 2002年度: 21,000千円 (直接経費: 21,000千円); 2001年度: 25,000千円 (直接経費: 25,000千円)
• キーワード: TAPタグ / PAP法 / LC / MS / SH3ドメイン / PB1ドメイン / 保証付き逆2ハイブリッド法 / ユビキチン / プロテオーム / 2ハイブリッド法 / GIドメイン / PBIドメイン / PXドメイン / 蛋白質相互作用 / 酵母2ハイブリッド法 / 相互作用ドメイン

研究概要

1)抗タグ抗体を用いた複合体精製による相互作用の確認、プロファイリングおよび複合体全体の構成解明を効率的に推進する為に、新規タンデムアフィニティ精製(TAP)タグの開発を行った。変性剤存在下での精製に適用可能なHis6に加えてStrept-tagとFlag-tagを様々な順列で配置したタグを作製し、テスト蛋白質の精製効率から性質のよいものを選択した。これを用いて酵母の全SH3蛋白質遺伝子にタグコード配列をノックインした株を作製、架橋剤存在下での複合体精製とLC/MS/MSによる解析を進めている。
2)異なるタグで標識されたユビキチンを同時に発現し、双方のタグに対するアフィニティ精製を連続して行うことで、ポリユビキチン化蛋白質を高純度に精製するパラレルアフィニティタグ精製(PAP)法を開発し、得られた蛋白質のLC/MS/MSによる網羅的同定を行った。同定された蛋白質に関しては個別にユビキチン化を検討して、この方法による検出の正当性を実証した。
3)保証付き逆2ハイブリッド法による相互作用変異体の単離法の開発と応用を進めた。その結果、これまで解析が難航していたほ乳類細胞極性蛋白質Par6とaPKCの相互作用や、出芽酵母の細胞極性蛋白質BEM1とCDC42の相互作用の解析に成功し、本法の有効性が実証された。前者は更に我々が見い出したPB1ドメインの認識機構の研究に、後者は新規CDC42結合ドメインの発見へと研究が展開している。これらの経験も踏まえて、保証付き逆2ハイブリッド法を用いて得られた相互作用変異体と同時に相互作用への中立変異体とを配列決定することで相互作用モチーフの同定が効率的に進展できる可能性が示された。

研究成果

• [文献書誌] Ponting, C.P. et al.: "OPR, PC and AID : all in the PB1 family"Trends Biochem. Sci.. 27(1). 10-10 (2002)
• [文献書誌] Oyama, T. et al.: "Extraction of knowledge on protein-protein interaction by association rule discovery"Bioinformatics. 18(5). 705-714 (2002)
• [文献書誌] Ito, T.et al.: "Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome"Mol. Cell. Proteomics. 1(8). 561-566 (2002)
• [文献書誌] Maeng, H.Y.et al.: "Appearance of osteonectin-expressing fibroblastic cells in early rat stomach carcinogenesis and stomach tumors induced with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine"Jpn. J. Cancer Res.. 93(9). 960-967 (2002)
• [文献書誌] Kuribayashi, F. et al.: "The adaptor protein p40^<phox> as a positive regulator of the superoxide-producing phagocyte oxidase"EMBO J.. 21(23). 6312-6320 (2002)
• [文献書誌] Ago, T.et al.: "Phosphorylation of p47phox directs PX domain from SH3 domain toward phosphoinositides, leading to activation of the phagocyte NADPH oxidase"Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 100(in press). (2003)
• [文献書誌] Ito, T., Chiba, T., Ozawa, R., Yoshida, M., hattori, M., Sakaki: "A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome"Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98. 4569-4574 (2001)
• [文献書誌] Kubota, H., Ota, K., Sakaki, Y., Ito, T.: "Budding yeast GCN1 binds the GI domain to activate the eIF2alpha kinase GCN2"J. Biol. Chem.. 276. 17591-17596 (2001)
• [文献書誌] Hiroaki, H., Ago, T., Ito, T., Sumimoto, H., Kohda, D.: "Solution structure of the PX domain, a target of the 5H3 domain"Nature Struct. Biol.. 8. 526-530 (2001)
• [文献書誌] Ito, T., Matsui, Y., Ago, T., Ota, K., Sumimoto, H.: "Novel modular domain PB1 recognizes PC motif to mediate functional protein-protein interactions"EMBO J.. 20. 3938-3946 (2001)
• [文献書誌] Terasawa, H., Noda, Y., Ito, T., Hatanaka, H., Ichikawa, S.et al.: "Structure and ligand recognition of the PB1 domain : a novel protein module binding to the PC motif"EMBO J.. 20. 3947-3956 (2001)
• [文献書誌] Ago, T., Takeya, R., Kuribayashi, F., Hiroaki, H., Ito, T., et al.: "The PX domain as a novel phosphoinositide-binding module"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 287. 733-738 (2001)
• [文献書誌] Ito,T. et al.: "Toward a protein-protein interaction map of the budding yeast : a comprehensive system to examine two-hybrid interactions in all possible combinations between the yeast proteins"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97(3). 1143-1147 (2000)
• [文献書誌] Kubota,H. et al.: "GI domain-mediated association of the eukaryotic initiation factor 2 alpha kinase GCN2 with its activator GCN1 is required for general amino acid control in budding yeast"J.Biol.Chem.. 275(27). 20243-20246 (2000)
• [文献書誌] Shiose,A. et al.: "Arachidonic acid and phosphorylation synergistically induce a conformational change of p47phox to activate the phagocyte NADPH oxidase"J.Biol.Chem.. 275. 13793-13801 (2000)
• [文献書誌] Noda,Y. et al.: "Human homologues of the Caenorhabditis elegans cell polarity protein PAR6 as an adaptor that links the small GTPases Rac and Cdc42 to atypical protein kinase C"Genes Cells. 6(2). 107-120 (2001)
• [文献書誌] Ito,T. et al.: "A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 98(in press). (2001)
• [文献書誌] Kubota,H. et al.: "Budding yeast GCN1 binds GI domain to activate the eIF2alpha kinase GCN2"J.Biol.Chem.. 276(in press). (2001)