脳の老化により発現・機能が変化しアルツハイマー病の発症を促進する因子の同定

• 研究課題/領域番号: 12210021
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 国立長寿医療センター(研究所) (2002-2004); 国立精神・神経センター (2000-2001)
• 研究代表者: 田平 武 国立長寿医療センター, (研究所), 研究所長 (80112332)
• 研究分担者: 田中 愼 国立長寿医療センター, 研究所, 室長 (70134624) ; 荒木 亘 (荒本 亘) 国立精神・神経センター, 神経研究所, 室長 (60311429) ; 原 英夫 国立精神・神経センター, 神経研究所・6部, 室長 (00260381) ; 高橋 慶吉 国立精神・神経センター, 神経研究所・6部, 室長 (40117148)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 55,600千円 (直接経費: 55,600千円); 2004年度: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円); 2003年度: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円); 2002年度: 16,000千円 (直接経費: 16,000千円); 2001年度: 19,600千円 (直接経費: 19,600千円)
• キーワード: アルツハイマー病 / βアミロイド / アポトーシス / グリピカン1 / ネプリライシン / 老化 / アドプリン / エービーティップ / アミロイド / β蛋白 / グリピカン / ラフト / PS1 / PS2 / APP / DRAL / LIM / Alzheimer

研究概要

アルツハイマー病の発症には老化に関連する因子が関与していると考えられる。本研究では脳の老化に伴ってその発現や機能が変化し、アルツハイマー病の発症に関連する因子を同定することを目的として研究を行い、以下の研究成果が得られた。
1.細胞外マトリックスのヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)とβアミロイドの結合はよく1知られているが、細胞内Aβと結合するHSPGはまだよく知られていない。今回HSPGの一種glypican-1がARと結合することを新たに見出した。Glypican-1はAR産生工場といわれるraftに存在し、Aβモノマーよりオリゴマーをよく結合した。glypican-1はβアミロイドとともに老人斑に共存した。glypican-1を強発現する細胞にAβ1-40をかけると細胞死が増強された。
2.PS1変異株と野生株の間でdifferential displayを行い、変異特異的に発現変化する新規物質を見出しadoplinと命名した。adoplinは膜蛋白でPSとcomplexを形成した。adoplinを過剰発現するとAβ産生は増強した。adoplin抗体は老人斑を染めた。現在RNAiによりその機能を解析中である。
3.Aβ1-42をbaitとしてyeast two hybrid assayを行い、Aβ1-42と結合する新規物質を得、AB-DIPと命名した。この物質に対する抗体を作製し、免疫沈降により結合を確認した。AB-DIPはCARD及び核移行シグナルを有し、Aβによる細胞死を増強した。
4.Neprilysin (Nep)はAβモノマーの主たる分解酵素で、脳の老化により発現が低下し、アルツハイマー病の発症促進因子となっている。そこで、Nepノックアウトマウスとプレセニリン1(PS1)
トランスジェニックマウスをかけ合わせ、AD病変の発現が促進するか調べたが、変化を見出さ

研究成果

• [雑誌論文] A novel death-inducing protein, AB-DIP interacts with amyloid beta protein and mediates its neurotoxicity. (2005)
  • 著者名/発表者名: Lakshmana MK, Araki W, Tabira T
  • 雑誌名: FASEB J (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Intracellular Abeta42 activates p53 promoter : a pathway to neurodegeneration in Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohyagi Y, Asahara H, Chui DH, Tsuruta Y, Sakae N, Miyoshi K, Yamada T, Kikuchi H, Taniwaki T, Murai H, Ikezoe K, Furuya H, Kawarabayashi T, Shoji M, Checler F, Iwaki T, Makifuchi T, Takeda K, Kira JI, Tabira T
  • 雑誌名: FASEB J 19 ページ: 255-257
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Association between tau polymorphism and male early-onset Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tanahashi H, Asada T, Tabira T
  • 雑誌名: NeuroReport 15 ページ: 175-180
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Enhanced generation of intracellular Aβ42 amyloid peptide by mutation of presenilins PS1 and PS2. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K, Wataru A, Tabira T
  • 雑誌名: Eur J Neurosci 19 ページ: 258-264
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Endogenous glucocorticoids are essential for maintaining prefrontal cortical cognitive function. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mizoguchi K, Ishige A, Takeda S, Aburada M, Tabira T
  • 雑誌名: J Neurosci 24 ページ: 5492-5499
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Glypican-1 as an Aβ binding HSPG in the human brain : its localization in DIG domains and possible roles in the pathogens is of Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Araki W, Chui DH, Makibuchi T, Ihara Y, Tabira T
  • 雑誌名: FASEB J 18 ページ: 1013-1015
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Monsonego A, Yuasa K, Adachi K, Xiao X, Takeda S, Takahashi K, Weiner HL, Tabira T
  • 雑誌名: J Alzheim Dis 6 ページ: 483-488
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Molecular basis of Alzheimer's disease : From amyloid hypothesis to treatment in the foreseeable future. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tabira T
  • 雑誌名: Ger Geront Intr 4
  • NAID: 10018027129
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Amino-truncated amyloid beta-peptide (Abeta5-40/42) produced from caspase-cleavedamyloidprecursorproteinisdeposited Alzmimer's disease brain. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K, Araki W, Akiyama H, Tabira T
  • 雑誌名: FASEB J 18 ページ: 1755-1757
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Association between tau polymorphism and male early-onset Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tanahashi H, Asada T, Tabira T.
  • 雑誌名: NeuroReport 15 ページ: 175-180
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Endogenous glucocorticoids are essential for maintaining prefrontal cortical cognitive function. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mizoguchi K, Ishige A, Takeda S, Aburada M, Tabira T.
  • 雑誌名: J Neurosci 24 ページ: 5492-5499
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Glypican-1 as an Aβ binding HSPG in the human brain : its localization in DIG domains and possible roles in the pathogenesis of Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Araki W, Chui DH, Makibuchi T, Ihara Y, Tabira T.
  • 雑誌名: FASEB J 18 ページ: 1013-1015
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hara H, Monsonego A, Yuasa K, Adachi K, Xiao X, Takeda S, Takahashi K, Weiner HL, Tabira T.
  • 雑誌名: J Alzheim Dis 6 ページ: 483-488
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular basis of Alzheimer's disease : From amyloid hypothesis to treatment in the foreseeable future. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tabira T.
  • 雑誌名: Ger Geront Intr 4
  • NAID: 10018027129
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Amino-truncated amyloid beta-peptide (Abeta5-40/42) produced from caspase-cleaved amyloid precursor protein is deposited in Alzheimer's disease brain. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K, Araki W, Akiyama H, Tabira T.
  • 雑誌名: FASEB J 18 ページ: 1755-1757
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Intracellular Abeta42 activates p53 promoter : a pathway to neurodegeneration in Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohyagi Y, Asahara H, Chui DH, Tsuruta Y, Sakae N, Miyoshi K, Yamada T, Kikuchi H, Taniwaki T, Murai H, Ikezoe K, Furuya H, Kawarabayashi T, Shoji M, Checler F, Iwaki T, Makifuchi T, Takeda K, Kira JI, Tabira T.
  • 雑誌名: FASEB J 19 ページ: 255-257
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Enhanced generation of intracellular Aβ42 amyloid peptide by mutation of presenilins PS1 and PS2. (2004)
  • 著者名/発表者名: Takeda K, Wataru A, Tabira T.
  • 雑誌名: Eur J Neurosci 19 ページ: 258-264
• [雑誌論文] Glypican-1 as an Aβ binding HSPG in the human brain : its localization in DIG domains and possible roles in the pathogens is of Alzheimer's disease. (2004)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Araki W, Chui DH, Makibuchi T, Ihara Y, Tabira T.
  • 雑誌名: FASEB J 18 ページ: 1013-1015
• [雑誌論文] A clinical and pathological study of a Japanese case of amyotrophic lateral sclerosis/Parkinsonism-dementia complex with family history. (2003)
  • 著者名/発表者名: Konagaya M, Kato T, Sakai M, Kuru S, Matsuoka Y, Konagaya Y, Hashizume Y, Tabira T
  • 雑誌名: J Neurol 250 ページ: 164-170
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Genetic, clinical and pathological studies of CADASIL in Japan : a partial contribution of Notch3 mutations and implications of smooth muscle cell degeneration for the pathogenesis. (2003)
  • 著者名/発表者名: Santa Y, Uyama E, Chui DH, Arima M, Kotorii S, Takahashi K, Tabira T
  • 雑誌名: J Neurol Sci 212 ページ: 79-84
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Differential expression of presenilin-α and -β (PSα and PSβ) in Xenopus laevis : embryonic phosphorylation of PSα. (2003)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Y, Tsujimura A, Tabira T, Hashimoto-Gotoh T
  • 雑誌名: Gene 314 ページ: 165-172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A unifying model for functional difference and redundancy of presenilin-1 and -2 in cell apoptosis and differentiation. (2003)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto-Gotoh T, Tsujimura A, Watanabe Y, Tabira T et al.
  • 雑誌名: Gene 323 ページ: 115-123
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Alzheimer's disease : mechanisms and development of therapeutic strategies. (2003)
  • 著者名/発表者名: Tabira T
  • 雑誌名: Geriat Geront Internat 3 ページ: 175-188
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A clinical and pathological study of a Japanese case of amyotrophic lateral sclerosis/Parkinsonism-dementia complex with family history. (2003)
  • 著者名/発表者名: Konagaya M, Kato T, Sakai M, Kuru S, Matsuoka Y, Konagaya Y, Hashizume Y, Tabira T.
  • 雑誌名: J Neurol 2003 250 ページ: 164-170
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Genetic, clinical and pathological studies of CADASIL in Japan : a partial contribution of Notch3 mutations and implications of smooth muscle cell degeneration for the pathogenesis. (2003)
  • 著者名/発表者名: Santa Y, Uyama E, Chui DH, Arima M, Kotorii S, Takahashi K, Tabira T.
  • 雑誌名: J Neurol Sci 212 ページ: 79-84
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Differential expression of presenilin-α and -β (PSα and PSβ) in Xenopus laevis : embryonic phosphorylation of PSα. (2003)
  • 著者名/発表者名: Watanabe Y, Tsujimura A, Tabira T, Hashimoto-Gotoh T.
  • 雑誌名: Gene 314 ページ: 165-172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A unifying model for functional difference and redundancy of presenilin-1 and -2 in cell apoptosis and differentiation. (2003)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto-Gotoh T, Tsujimura A, Watanabe Y, Iwabe N, Miyata T, Tabira T.
  • 雑誌名: Gene 323 ページ: 115-123
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Alzheimer's disease : mechanisms and development of therapeutic strategies. (2003)
  • 著者名/発表者名: Tabira T.
  • 雑誌名: Geriat Geront Internat 3 ページ: 175-188
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Significance of intracellular Abeta42 accumulation in Alzheimer's disease. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tabira T, Chui DH, Kuroda S
  • 雑誌名: Front Biosci 7
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] c954C>T polymorphism in the Fe65L2 gene is associated with early-onset Alzheimer's disease. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tanahashi, H, Asada T, Tabira T
  • 雑誌名: Ann Neurol 52 ページ: 691-693
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterization of an amyloid precursor protein (APP)-binding protein Fe65L2 and its two novel isoforms lacking phosphotyrosine interaction domain. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tanahashi H, Tabira T
  • 雑誌名: Biochem J 367 ページ: 687-695
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Alzheimer_s disease with spastic paresis and cotton wool type plaques. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tabira T, Chui DH, Nakayama H, Kuroda S, Shibuya M
  • 雑誌名: J Neurosci Res 70 ページ: 367-372
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Alzheimer_s disease with spastic paresis and cotton wool type plaques. (2002)
  • 著者名/発表者名: Tabira T, Chui DH, Nakayama H, Kuroda S, Shibuya M.
  • 雑誌名: J Neurosci Res 70 ページ: 367-372
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A novel death-inducing protein, AB-DIP interacts with amyloid beta protein and mediates its neurotoxicity.
  • 著者名/発表者名: Lakshmana MK, Araki W, Tabira T.
  • 雑誌名: FASEB J (inpress)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [産業財産権] Adoplinタンパク質、およびその利用 (2005)
  • 発明者名: 荒木 亘, 田平 武
  • 権利者名: (財)ヒューマンサイエンス振興財団
  • 産業財産権番号: 2005-026405
  • 出願年月日: 2005-02-02
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] アルツハイマー病治療のための組換アデノ随伴ウイルスベクター (2004)
  • 発明者名: 田平 武, 原 英夫
  • 権利者名: 国立長寿医療センター, 医薬品被害救済調査審議機構
  • 出願年月日: 2004-06-11
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] AB-DIP、並びにアルヅハイマー病の予防及び治療剤 (2004)
  • 発明者名: 田平 武, 荒木亘, マデパリ・ケイ・ラクシュマナ
  • 権利者名: (財)ヒューマンサイエンス振興財団
  • 産業財産権番号: 2004-367780
  • 出願年月日: 2004-12-20
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] タウ遺伝子中の遺伝子多型を利用したアルツハイマー病の発症リスクの予測法およびこれに陥るための核酸分子 (2003)
  • 発明者名: 棚橋 浩, 木村英雄, 田平 武, 朝田 隆
  • 権利者名: 国立精神・神経センター医薬品被害救済調査審議機構
  • 産業財産権番号: 2003-299939
  • 出願年月日: 2003-08-25
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] アルツハイマー病治療のための組換アデノ随伴ウイルスベクター (2003)
  • 発明者名: 田平 武, 原 英夫
  • 権利者名: 国立療養所中部病院太田壽城, 医薬品被害救済調査審議機構
  • 出願年月日: 2003-06-13
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [産業財産権] アルツハイマー病の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子 (2002)
  • 発明者名: 棚橋 浩, 田平 武, 朝田 隆
  • 権利者名: 医薬品被害救済調査審議機構, 国立精神・神経センター ジェノックス創薬研究所
  • 産業財産権番号: 2002-181728
  • 出願年月日: 2002-06-21
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Konagaya M, Kato T, Sakai M, Kuru S, Matsuoka Y, Konagaya Y, Hashizume Y, Tabira T.: "A clinical and pathological study of a Japanese case of Amyotrophic Lateral Sclerosis/Parkinsonism-Dementia Complex with family history."J Neurol. 250. 164-170 (2003)
• [文献書誌] Santa Y, Uyama E, Chui DH, Arima M, Kotorii S, Takahashi K, Tabira T.: "Genetic, clinical and pathological studies of CADASIL in Japan : a partial contribution of Notch3 mutations and implications of smooth muscle cell degeneration for the pathogenesis."J Neurol Sci. 212. 79-84 (2003)
• [文献書誌] Watanabe Y, Tsujimura A, Tabira T, Hashimoto-Gotoh T.: "Differential expression of presenilin-α and -β (PSα and PSβ) in Xenopus laevis : embryonic phosphorylation of PSα."Gene. 314. 165-172 (2003)
• [文献書誌] Hashimoto-Gotoh T, Tsujimura A, Watanabe Y, Iwabe N, Miyata T, Tabira T.: "A unifying model for functional difference and redundancy of presenilin-1 and -2 in cell apoptosis and differentiation."Gene323:115-123,2003. 115-123 (2003)
• [文献書誌] Tabira T.: "Alzheimer's disease : mechanisms and development of therapeutic strategies."Geriat Geront Internat. 3. 175-188 (2003)
• [文献書誌] Tanahashi H, Asada T, Tabira T.: "Association between tau polymorphism and male early-onset Alzheimer's disease."Neuro Report. 15. 175-180 (2004)
• [文献書誌] Takeda K, Wataru A, Tabira T.: "Enhanced generation of intracellular Aβ42 amyloid peptide by mutation of presenilins PS1 and PS2."Eur J Neurosci. 19. 258-264 (2004)
• [文献書誌] Konagaya M, Kato T, Sakai M, Kuru S, Matsuoka Y, Konagaya Y, Hashizume Y, Tabira T: "A clinical and pathological study of a Japanese case of amyotrophic lateral sclerosis/Parkinsonism-dementia complex with family history"J Neurol. 250. 164-170 (2003)
• [文献書誌] Tabira T, Chui DH, Kuroda S: "Significance of intracellular Abeta42 accumulation in Alzheimer's disease"Front Biosci. 7. A44-9 (2002)
• [文献書誌] Tanahashi, H, Asada T, Tabira T: "c954C>T polymorphism in the Fe65L2 gene is associated with early-onset Alzheimer's disease"Ann Neurol. 52. 691-693 (2002)
• [文献書誌] Tanahashi H, Tabira T: "Characterization of an amyloid precursor protein (APP)-binding protein Fe65L2 and its two novel isoforms lacking phosphotyrosine interaction domain"Biochem J. 367. 687-695 (2002)
• [文献書誌] Tabira T, Chui DH, Nakayama H, Kuroda S, Shibuya M: "Alzheimer's disease with spastic paresis and cotton wool type plaques"J Neurosci Res. 70. 367-372 (2002)
• [文献書誌] Chui DH, Takahashi K, Tabira T et al.: "Apoptotoc neurons in Alzheimer's disease frequently show intracellular A42 labeling"J Alzheimer Dis. 3. 231-239 (2001)
• [文献書誌] Miyamoto K, Tabira T, Ikemoto A et al.: "Familial frontotemporal dementia and parkinsonism with a novel mutation at an intron 10+11-splice site in the tau gene"Ann Neurol.. 50. 117-120 (2001)
• [文献書誌] Tabira T.: "Clioquinol's return : cautions from Japan (letter to the editor)"SCIENCE.. 292. 2251 (2001)
• [文献書誌] Tanahashi H, Tabira T.: "Three novel alternatively spliced isoforms of the human β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme (BACE) and their effect on amyloid β-peptide production"Neurosci Lett. 307. 9-12 (2001)
• [文献書誌] Mann DMA, Familial Alzheimer's Dis. Study Group (Tabira T et al.): "Amyloid angiopathy and variability in amyloid beta deposition is determined by mutation position in presenilin-1-linked Alzheimer's disease"Am J Pathol. 158. 2165-2175 (2001)
• [文献書誌] Araki W, Yuasa K, Tabira T et al.: "Proapoptotic effect of presenilin 2 (PS2) overexpression is associated with down-regulation of Bcl-2 in cultured neurons"J Neurochem. 79. 1-9 (2001)
• [文献書誌] Tanahashi H,Tabira T: "Alzheimer's disease-associated presenilin 2 interacts with DRAL, an LIM-domain protein."Hum Mol Genet. 9(15). 2281-2289 (2000)
• [文献書誌] Sawamura N,Morishima-Kawashima M,Waki H,Kobayashi K,Kuramochi T,Frosch MP,Ding K,Ito M,Kim TW,Tanzi RE,Oyama F,Tabira T,Ando S,Ihara Y: "Mutant presenilin 2 transgenic mice. A large increase in the levels of abeta 42 is presumably associated with the low density membrane domain that contains decreased levels of glycerophospholipids and sphingomyelin."J Biol Chem. 275(36). 27901-27908 (2000)
• [文献書誌] Kodama K,Okada S,Iseki E,Kowalska A,Tabira T,Hosoi N,Yamanouchi N,Noda S,Komatau N,Nakaznto M,Kumakiri C,Yazaki M,Sato T: "Familial frontotemporal dementia with a P301L taumutation in Japan."J Neurol Sci. 176(1). 57-64 (2000)
• [文献書誌] Arima K,Kowalska A,Hasegawa M,Mukoyama M,Watanabe R,Kawai M,Takahashi K,Goedert M,Iwatsubo T,Tabira T,Sunohara N: "Two brothers of frontotemporal dementia and parkinsonism with an N279K mutation of the tau gene."Neurology. 54(9). 1787-1795 (2000)
• [文献書誌] Shirotani K,Takahashi K,Araki W,Tabira T: "Mutational analysis of intrinsic regions of presenilin 2 which determine its endoproteolytic cleavage and pathological function."J Biol Chem. 275(5). 3681-3686 (2000)
• [文献書誌] Mizoguchi K,Yuzurihara M,Ishige A,Sasaki H,Chui DH,Tabira T: "Chronic stress induces impairment of spatial working memory because of prefrontal dopaminergic dysfunction."J Neurosci. 20(4). 1568-1574 (2000)