| 研究課題/領域番号 |
12210139
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| 研究種目 |
特定領域研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
石黒 啓司 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助教授 (20211039)
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| 研究分担者 |
山田 晃司 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 研究技術員 (60278306)
西井 一宏 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 研究技術員 (50278305)
澤田 浩秀 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助手 (30247663)
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| 研究期間 (年度) |
2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| キーワード | ハンチントン病 / CAGリピート / 細胞内発現抗体 / モデルマウス / 線状体 |
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| 研究概要 |
ハンチントン病(HD)はHD遺伝子のエクソン1の存在するCAGリピートの異常伸長が原因と考えられる神経変性疾患である。本研究は、この遺伝子産物の機能と構造の解明、及び遺伝子治療に向けたツールの作製を目的としている。はじめに、28、42、77及び107CAGリピートを持つヒトHD遺伝子エクソン1を各種発現ベクターに導入した。この発現遺伝子を大腸菌内に挿入して蛋白質の産生を試みたが、大腸菌自身の増殖が極めて悪かった。28CAGリピートを持つエクソン1に関してはわずかに蛋白質の産生を確認した。また、エクソン2-8とエクソン12-13を同様の発現系にて蛋白質の精製を試みた。その結果、エクソン12-13に関して大腸菌体に蛋白質を分泌していることが発現誘導剤(IPTG)の処理から判明した。この蛋白質はインテリンーキチン結合蛋白質との融合蛋白質であり、カラム中にて還元剤と静置することで目的の蛋白質を切断、精製することができた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、ほぼ95%以上の精製蛋白質と確認した。この領域は4ヶ所のカスパーゼ3切断部位が存在しており、HDの神経変性に関与した核内凝集体の形成に必須の蛋白質部位と考えられている。このリコンビナント蛋白質を用いてファージ抗体ライブラリーから抗体の精製を行っている。また、この蛋白質部分を用いてマウスとウサギに免疫を開始した。マウスは免疫後、脾臓を摘出して抗体遺伝子用cDNAライブラリーを作製し、ファージ抗体ライブラリーとして使用する。また、ウサギから免疫血清を作製してカスパーゼ3切断部位の構造解析及びカスパーゼ機能阻害活性の標準抗体とする。
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