| 研究課題/領域番号 |
12213073
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| 研究種目 |
特定領域研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
和賀 祥 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (60222402)
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| 研究期間 (年度) |
2000
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2000年度: 3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
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| キーワード | DNA複製 / ブルーム症候群 / BLMヘリカーゼ / アフリカツメガエル卵抽出液 / 分子生物学 |
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| 研究概要 |
早期発がんを特徴とする遺伝病であるブルーム症候群の原因遺伝子BLMは、RecQファミリーに属するDNAヘリカーゼをコードする。本研究ではBLMとDNA複製との関連性に注目し、SV40 in vitro DNA複製系ならびにアフリカツメガエル卵抽出液を用いたDNA複製系を利用した生化学的な解析によりBLMの機能を明らかにすることを本研究の目的とした。
ブルーム症候群由来細胞(BS細胞)ならびに正常細胞から調製した細胞抽出液を用いてSV40 in vitro DNA複製を行った結果、複製のみが起こる反応条件下では、両細胞抽出液の間で顕著な違いは見られなかった。しかし、DNA複製と連携したクロマチン形成反応を行わせる条件下では、BS細胞特異的に、形成されたクロマチンの断片化が検出された。この現象がBLMの欠損によるものであることを確認するために、BLMのバキュロウイルス発現系を確立し、組換え体BLMの精製を行った。しかし、その後BS細胞の継代維持に問題が生じ、BS細胞抽出液を使った解析が困難となった。
そこで、SV40 DNA複製系にかわって、アフリカツメガエル卵抽出液を使ったin vitro DNA複製系での解析を進めた。BLMのアフリカツメガエルホモログをコードするcDNAを取得し、その特異的な抗体を作製した。DNA複製時のカエルBLMの動態を解析した結果、DNAポリメラーゼ阻害剤アフィディコリンで複製進行を止めたり、制限酵素処理で鋳型クロマチンにDNA二重鎖切断を導入すると、BLMのクロマチン結合がやや増加することが示された。さらに、複製開始阻害タンパク質geminineを加え複製を阻害した条件下でもクロマチン結合が有意に検出されたことから、BLMには進行停止複製フォークや二重鎖DNA切断部位における機能とは異なる機能も有する可能性が推測される。
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