| 研究課題/領域番号 |
12215027
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| 研究種目 |
特定領域研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉田 進昭 東京大学, 医科学研究所, 教授 (10250341)
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| 研究分担者 |
市瀬 広武 東京大学, 医科学研究所, 助手 (10313090)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2000年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | MAPキナーゼ / erk1 / erk2 / マウス |
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| 研究概要 |
マウスerk1,erk2遺伝子の全長を含むインサートサイズ30kb以上のゲノムDNAクローンを用いて、それぞれヒト由来翻訳調節配列の下流にレポーター遺伝子を接続したカセットをエクソンに挿入した発現ベクターを構築した。このベクターを培養細胞に導入し、発現ベクターとして機能的であることを確認した上で、実際のターゲティングに使用するのに適当な領域をサブクローニングする手法を試みている。1)erk1遺伝子はマウスゲノムDNAライブラリーのスクリーニングによって単離し、使用した。erk2遺伝子は、マウスの整列化P1ゲノムDNAライブラリーのクローンを購入して使用した。2)ヒトNRF(NF-κ B releasing Factor)の5'UTRはCap構造に依存せず、組織非特異的に機能し、翻訳効率に優れていることが示唆されている。、このヒトNRF5'UTRのknock-inストラテジーにおける利用を目的としてクローニングした。ヒトゲノムDNAを鋳型としたPCR産物をクローニングした。3)ヒトNRF5'UTRの下流に、2個のloxPサイト、ポリAシグナル配列を接続し、loxPサイト間に任意のcDNAを挿入できるカセットを作成した。このカセットを、erk1遺伝子およびerk2遺伝子のエクソンに挿入した。被挿入側のerk1およびerk2遺伝子は、Fosmid、P1のクローンをそれぞれ使用し、カセット挿入位置の異なる数種類のプラスミドを得た。これらのプラスミドのloxPサイト間にレポーター遺伝子のcDNAを挿入したものを作成後、培養細胞に導入した。現在、レポーター遺伝子の発現を元に、knock-inベクターのバックボーンとして最適と考えられるクローンを選択している。
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