| 研究課題/領域番号 |
12215073
|
|---|
| 研究種目 |
特定領域研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 審査区分 |
生物系
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
高橋 淳 京都大学, 医学研究科, 助手 (80303840)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2000
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2000年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
2000年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
|
|---|
| キーワード | アポトーシス / カスパーゼ / FEAT-74 / メチル基転位酵素 |
|---|
| 研究概要 |
カスパーゼ3によるp74切断のアポトーシス核変化における役割カスパーゼ3を欠損している乳癌細胞株MCF7にN末端にmycタグを付けたp74を発現させ、スタウロスポリンでアポトーシスを誘導した。myc-p74の切断は、MCF7ではほとんど認められないが、myc-p74と同時にカスパーゼ3を共発現させると、2つの断片を生ずること、つまりカスパーゼ3により少なくとも2ケ所で切断されることが明らかになった。
第一の部位は、断片のサイズから、2つのメチル基転位酵素様ドメインの間にあることが予想され、カスパーゼはアスパラギン酸のC末端側で切断することから、候補となる4ケ所のアスパラギン酸をアラニンに変える変異を導入し、ウサギ網状赤血球in vitro転写/翻訳システムで35Sラベルしたタンパクを合成して、カスパーゼ3による切断を調べところ、4ケ所のうち2ケ所(m1,m2)で切断されることがわかった。もう一つの切断部位は、N末端側のメチル基転位酵素様のドメインの内部にあることが予想されたため、候補となる3ケ所に変異を導入して、同様に調べたところ、そのうちの1ケ所(m3)の変異で切断が消失した。
切断されない変異型p74をヒスチジン融合タンパクとして大腸菌に発現させ、ニッケルカラムで精製することを試みたが、水溶性の状態で発現させることには、成功しなかった。そこで、無細胞系ではなく、培養細胞で変異型p74の機能を解析した。野生型または変異型p74をコードするcDNAを、緑色蛍光タンパク(GFPをコードするcDNAと共に293Fas細胞に導入した後に、Fasに対する抗体でアポトーシス細胞死を誘導し、CFP発現細胞を選択して解析し、変異型p74の過剰発現のアボトーシス核変化に対する影響を調べた。野生型のp74は、アポトーシスに影響しなかったが、(m1+m2)変異のあるp74は、アポトーシスを抑制した。
|
