がん細胞におけるアポトーシスの分子解析

• 研究課題/領域番号: 12215156
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 京都大学 (2001-2004); (財)大阪バイオサイエンス研究所 (2000)
• 研究代表者: 垣塚 彰 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (80204329)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 46,600千円 (直接経費: 46,600千円); 2004年度: 7,800千円 (直接経費: 7,800千円); 2003年度: 7,800千円 (直接経費: 7,800千円); 2002年度: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円); 2001年度: 11,000千円 (直接経費: 11,000千円); 2000年度: 10,000千円 (直接経費: 10,000千円)
• キーワード: ポリグルタミン / 神経細胞死 / AAA ATPase / アミノ酸修飾 / VCP / 出芽酵母 / 腺癌 / 扁平上皮癌 / 酸化修飾 / ATPase活性 / 温度感受性株 / 細胞死 / Hsp70 / RNAi / 細胞周期 / 亜砒酸 / 前立腺ガン / p97 / APL / ASK1 / 酸化ストレス / SEK1 / スプライニングバリアント

研究概要

細胞死・細胞増殖に関わる新規遺伝子・蛋白質として同定したAAA familyのATPaseであるVCP蛋白質について解析を行い、以下の諸点を明らかにした。
(1)抗VCP抗体を用いて、正常組織及び各種癌組織でVCPの発現を解析した。マウス正常組織では、管腔構造をとる上皮系の細胞や免疫系細胞、乳腺上皮、胃酸合成細胞などの分泌系の細胞に強い発現を認めた。一方、ヒト癌由来の組織では、特に腺癌と扁平上皮癌に強い発現を認めた。
(2)RNAi法を用いて、HeLa細胞で内在性のVCPを98%以上ノックダウンすることに成功した。このHeLa細胞では、紡錘体極の数が不安定になり、娘細胞に正しく染色体を分配することができなくなっていた。その結果、M期の終了後、細胞周期の停止もしくは細胞死に陥っていた。
(3)VCP蛋白質内であるリン酸化を受けたアミノ酸を特異的に認識する抗体を作成し、培養細胞を免疫染色すると紡錘体極やセントロゾームが染色された。
(4)外来性のVCPを誘導発現させることができる出芽酵母を作り、その酵母をEMSで処理してDNA変異を導入後、VCPの存在の有無で発育に差のでる温度感受性株を得た。その温度感受性株をゲノムライブラリーでトランスフォームし、温度感受性をレスキューする8つのゲノム断片を得た。
(5)VCPをアセチル化する酵素の精製を進め、アセチル化活性のある分画に特異的と思われる蛋白質のバンドを数個にまで絞り込むことができた。

研究成果

• [雑誌論文] alpha, beta -unsaturated ketone is a core moiety of natural ligands for covalent binding to peroxisome proliferator-activated receptor gamma. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shiraki, T., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279(In press)
• [雑誌論文] Effective treatment of advanced solid tumors by the combination of Arsenic Trioxide and L-Buthionine-Sulfoximine. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maeda, H., et al.
  • 雑誌名: Cell Death Differ. 7 ページ: 737-746
• [雑誌論文] Alteration in thee cellular response to retinoic acid of a human acute promyelocytic leukemia cell line, UF-1, carrying a patient-deriveed mutant PML-RARα chimeric gene. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sato, A., et al.
  • 雑誌名: Leukemia Res. 9 ページ: 959-9667
• [雑誌論文] The role of pre-existing aggregates in Hsp104-dependent polyglutamine aggregate formation and epigenetic change of yeast prions. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kimura, Y., et al.
  • 雑誌名: Genes Cells 8 ページ: 685-696
• [雑誌論文] A mutant ataxin-3 putative-cleavage fragment in brain of Machado-Joseph disease patients and transgenic mice is cytotoxic above a critical concentration. (2004)
  • 著者名/発表者名: Goti, D., et al.
  • 雑誌名: J.Neuroscience 24 ページ: 10266-10279
• [雑誌論文] Physical and functional interaction between dorfin and valosin-containing protein that are colocalized in ubiquitylated inclusions in neurodegenerative disorders. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ishigaki, S., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 279 ページ: 51376-51385
• [文献書誌] Maeda, H., et al.: "Effective treatment of advanced solid tumors by the combination of Arsenic Trioxide and L-Buthionine-Sulfoximine."Cell Death Differ.. (In press). (2004)
• [文献書誌] Matsumoto, M., et al.: "Molecular clearance of ataxin-3 is regulated by a mammalian E4."EMBO J.. 23. 659-669 (2004)
• [文献書誌] Kobayashi, T., Kakizuka, A.: "Molecular analyses of Machado-Joseph disease."Cytogenet.Genome Res.. 100. 261-275 (2003)
• [文献書誌] Kimura, Y., Kakizuka, A.: "Polyglutamine diseases and molecular chaperones."IUBMB Life. 55. 337-345 (2003)
• [文献書誌] Kamei, Y., et al.: "PGC-1β/ERRL1 is an ERR protein ligand, whose expression induces a high-energy expenditure and"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.. 100. 12378-12383 (2003)
• [文献書誌] Mizuno, Y., et al.: "Vacuole-creating protein in neuro-degenerative diseases."Neurosci.Lett.. 343. 77-80 (2003)
• [文献書誌] Higashiyama, H., et al.: "Identification of ter94, Drosophila VCP, as a modulator of polyglutamine-induced neurodegenerations in Drosophila"Cell Death Differ.. 9. 264-273 (2002)
• [文献書誌] Nakamoto, M., et al.: "Unequal crossing-over in unique PABP2 Mutations : a possible cause of oculopharyngeal muscular dystrophy"Archives Neurology. 59. 474-477 (2002)
• [文献書誌] Nishitoh, H., et al.: "ASK1 is essential for endoplasmic reticulum stress-induced Neuronal cell death triggered by expanded polyglutamine repeats"Genes & Dev.. 16. 1345-1355 (2002)
• [文献書誌] Kimura, Y., et al.: "Circumvention of chaperone requirement for aggregate formation of a short polyglutamine tract by the co-expression of a long polyglutamine tract"J.Biol.Chem.. 277. 37536-37541 (2002)
• [文献書誌] Kobayashi, T., et al.: "Functional ATPase activity of p97/VCP is required for the quality control of endoplasmic reticulum in neuronally differentiated mammalian PC12 cells"J.Biol.Chem.. 277. 47358-47365 (2002)
• [文献書誌] Mizuno, Y., et al.: "Vacuole-creating protein in neurodegenerative diseases"Neurosci.Lett.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Yamamoto, Y., Hasegawa, H., Tanaka, K., Kakizuka, A.: "Isolation of neuronal cells with high processing activity for the Machado-Joseph disease protein"Cell Death Differ.. 8. 871-873 (2001)
• [文献書誌] Hirabayashi, M., Inoue, K., Tanaka, K., et al.: "VCP/p97 in abnormal protein aggregates, cytoplasmic vacuoles, and cell death, phenotypes relevant to neurodegeneration"Cell Death Differ.. 8. 977-984 (2001)
• [文献書誌] Maeda, H., Hori, S., Nishitoh, H., et al.: "Tumor growth inhibition by arsenic trioxide (As2O3) in the orthotopic metastasis model of androgen-independent prostate cancer"Cancer Res.. 61. 5432-5440 (2001)
• [文献書誌] Kimura, Y., Koitabashi, S., Kakizuka, A., Fujita, T.: "Initial process of polyglutamine aggregate formation in vivo"Genes Cells. 6. 887-897 (2001)
• [文献書誌] Higashiyama, H., Hirose, F., Yamaguchi, M., et al.: "Identification of ter94, Drosophila VCP, as a modulator of polyglutamine-induced neurodegenerations in Drosophila"Cell Death Differ.. 9. 264-273 (2002)
• [文献書誌] Nakamoto, M., Nakano, S., Kawashima, S., et al.: "Unequal crossing-over in unique PABP2 Mutations : a possible cause of oculopharyngeal muscular dystrophy"Archives Neurology. 59. 474-477 (2002)
• [文献書誌] Maeda,H.,Segawa,T.,Kamoto,T.,Yoshida,H.,Kakizuka,A.,Ogawa,O.,& Kakehi,Y.: "Rapid detection of candidate metastatic foci in the orthotopic inoculation model of androgen-sensitive prostate cancer cells introduced with green fluorescent protein."The Prostate. 45. 335-340 (2000)
• [文献書誌] Kakizuka,A.: "Molecular mechanisms underlying neuronal cell death in polyglutamine diseases."Neurochemical Research. 25. 990 (2000)
• [文献書誌] Yasuda,S,Hori,S.,Maeda,H.,Maeda,R.,Gotoh,Y.,Nishitoh,H.,Ichijo,H.,& Kakizuka,A.: "As2O3 treatment recruits Daxx and ASK1 to re-organized PML bodies and activates the SEK1-JNK cell death kinase cascade in APL cells."Cell Death & differentiation. (in revision).
• [文献書誌] Yamamoto,Y.,Hasegawa,H.,Tanaka,K.,& Kakizuka,A.: "Genetical isolation of neuronal cells with high processing activity for the Machado-Joseph disease protein."Cell Death & differentiation. (in revision).