がん治療をめざしたアデノウイルスベクターを用いた発現制御法の開発

• 研究課題/領域番号: 12217028
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 斎藤 泉 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70158913)
• 研究分担者: 鐘ヶ江 裕美 東京大学, 医科学研究所, 助手 (80251453) ; 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707) ; 多比良 和誠 東京大学, 工学系研究科, 教授 (10261778) ; 伊庭 英夫 東京大学, 医科学研究所, 客員教授 (60111449)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 171,000千円 (直接経費: 171,000千円); 2004年度: 30,000千円 (直接経費: 30,000千円); 2003年度: 30,400千円 (直接経費: 30,400千円); 2002年度: 30,000千円 (直接経費: 30,000千円); 2001年度: 30,600千円 (直接経費: 30,600千円); 2000年度: 50,000千円 (直接経費: 50,000千円)
• キーワード: アデノウイルスベクター / guttedベクター / 部位特異的組換え酵素 / Cre / loxP / FLP / FRT / 遺伝子治療 / 遺伝子置換反応 / ウイルスベクター / 発現制御 / アデノウイルス / ウィルスベクター / 遺伝子置換 / アデノウィルス / レトロウイルスベクター / リボザイム

研究概要

がんの遺伝子治療の実用化に向けて本研究ではがん細胞特異的高度発現機能を有する改良型アデノウイルスベクターとして、がん細胞特異的プロモーターから部位特異的組換え酵素を発現する「制御ユニット」と強力なプロモーターからの目的遺伝子の発現をOFFからONへと制御する「発現標的ユニット」を一つのウイルスベクターに組み込む「単一型特異的高度発現ベクター」作製法の開発を行ってきた。このベクターにはヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクター(guttedベクター)を応用するため、guttedベクターの効率的な作製法の開発が必須であり、部位特異的組換え酵素の遺伝子置換反応を応用した全く新しいベクター作製法の開発に取り組んでいる。一般的に発現効率が劣る細胞特異的プロモーターからの発現量を確保するために、制御ユニットには組換え効率が高いCreの応用が必須であり、ベクター作製にはFLPを応用する必要性が生じたが、FLPは組換え効率がCreと比べ劣るためFLPの改良を行ってきた。本年度はFLPの温度安定型として報告された4アミノ酸変異体FLPeと本研究で我々が新規に合成し作製したFLPeのcodon usageをヒト型化したhFLPeの組換え効率をFLPと詳細に比較した。新たに作製したペプチド抗体を用いた解析からhFLPeのタンパク質量はFLPと比べ数十倍上昇していたことが明らかとなったが、組換え効率はFLPやFLPeとほぼ同程度であり、高度に発現したFLPは細胞への影響を示す可能性が示唆された。しかし本研究で樹立化したFLPやhFLPe発現293細胞は、予想に反してCre発現293細胞よりも高い組換え効率とベクター生成効率を示しており、これらの細胞株を用いることでguttedベクター作製の高効率化が図られるものと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Prolonged skin allograft survival by IL-10 gene-introduced CD4 T cell administration. (2005)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto, T., Saito, I.et al.
  • 雑誌名: Int.Immunol. (in press)
  • NAID: 10019358742
• [雑誌論文] Practical range of effective dose for Cre recombinase-expressing recombinant adenovirus without cell toxicity in mammalian cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Baba, Y., Saito, I.et al.
  • 雑誌名: Microbiol.Immunol. 49・6(in press)
  • NAID: 10016132286
• [雑誌論文] The testicular fatty acid binding protein PERF15 regulates the fate of germ cells in PERF15 transgenic mice. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kido, T., Saito, I.et al.
  • 雑誌名: Dev Growth Differ. 47 ページ: 15-24
  • NAID: 10014431734
• [文献書誌] Kondo, S.et al.: "Simultaneous on/off regulation of transgenes located on a mammalian chromosome with Cre-exoressing adenovirus and a mutant loxP"Nucleic Acids Res.. 31. 76 (2003)
• [文献書誌] Horie, R. et al.: "Ligand-independent signaling by overexpressed CD30 drives NF-kappaB activation in Hodgkin-Reed-Sternberg cells"Oncogene. 21. 2493-2503 (2002)
• [文献書誌] Kim, J.M.et al.: "Inactivation of Cdc7 kinase in mouse ES cells results in S-phase arrest and p53-dependent cell death"Embo J.. 21. 2168-2179 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, H. et al.: "Enhanced skin carcinogenesis in cyclin D1-conditional transgenic mice : cyclin D1 alters keratinocyte response to calcium-induced terminal differentiation"Cancer Res.. 62. 1641-1647 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, H. et al.: "HST-1/FGF-4 gene activation induces spermatogenesis and prevents adriamycin-induced testicular toxicity"Oncogene. 21. 899-908 (2002)
• [文献書誌] Nakano, M. et al.: "DNA substrates influence the recombination efficiency mediated by FLP recombinase expressed in mammalian cells"Microbiol Immunol. 45. 657-665 (2001)
• [文献書誌] Nakano, M. et al.: "Efficient gene activation in cultured mammalian cells mediated by FLP recombinase-expressing recombinant adenovirus"Nucleic Acids Res.. 29. E40 (2001)
• [文献書誌] Sakai, Y. et al.: "Gene therapy for hepatocellular carcinoma using two recombinant adenovirus vectors with alpha-fetoprotein promoter and Cre/lox P system"J Virol Methods. 92. 5-17 (2001)
• [文献書誌] Takehara, M. et al.: "Long-term acceptance of allografts by in vivo gene transfer of reguiatable adenovirus vector containing CThA4IgG and loxP"Hum Gene Ther.. 12. 415-426 (2001)
• [文献書誌] Takiguchi,M. et.al.: "CTLA4IgG gene delivery prevents autoantibody production and lupus nephritis in MRL/lpr mice."Life Sci.. 66. 991-1001 (2000)
• [文献書誌] Wakita,T. et,al.: "Possible role of cytotoxic T cells in acute liver injury in hepatitis C virus cDNA transgenic mice mediated by Cre/loxP system."J.Med.Virol. 62. 308-317 (2000)
• [文献書誌] Sakai,Y. et.al.: "Gene therapy for hepatocellular carcinoma using two recombinant adenovirus vectors with alpha-fetoprotein promoter and Cre/lox P system."J.Virol.Method. (in press). (2001)
• [文献書誌] Nakano,M. et.al.: "Efficient gene activation in cultured mammalian cells mediated by FLP recombinase-expressing recombinant adenovirus."Nucl.Acids Res.. (in press). (2001)
• [文献書誌] Ui,M. et.al.: "Endogenous AP-1 levels necessary for oncogenic activity are higher than those sufficient to support normal growth."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 278. 97-105 (2000)
• [文献書誌] Warashina,M. et.al.: "Novel RNA-protein hybrid ribozymes efficiently cleave any mRNA independently of the structure of the target RNA."Proc.Natl.Acad.Su.USA. (in press). (2001)