| 研究課題/領域番号 |
12460150
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用分子細胞生物学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
福井 希一 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (00311770)
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| 研究分担者 |
藤原 伸介 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (90263219)
高木 昌宏 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00183434)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
12,400千円 (直接経費: 12,400千円)
2002年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
2001年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
2000年度: 5,100千円 (直接経費: 5,100千円)
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| キーワード | 染色体 / タンパク質 / GFP / 細胞核 / トポロジカルマッピング / 核タンパク質 / シロイヌナズナ / ゲルシフトアッセイ / 結晶化 / GFP融合cDNAライブラリー / デコンボリューション法 / アラビドプシス / 3次元可視化法 / ポストゲノム解析 |
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| 研究概要 |
Arabidopsis thalianaに対するランダムcDNA : GFP融合法によるスクリーニングの結果、単離した新規核局在タンパク質At-AHM1(Arabidopsis thaliana AT-hook motif and transmembrane domain containing Protein 1)の解析を行った。Blast検索によりAt-AHM1は植物にはホモログが多数存在するにもかかわらず、微生物、動物等、他の生物内では見つかっていない植物に特有のユニークなタンパク質であることがわかった。
スクリーニングにより得られた株を用いてデコンボリューション技法により細胞内局在性の詳細な動態解析を行うと、間期においてはAt-AHM1は核質中に局在するが、必ずしもDNAとの共存は認められなかった。一方で有糸分裂期には染色体上に移動していることがわかった。At-AHM1を組換えタンパク質として大腸菌で発現し、精製した。これを用いてDNA結合アッセイを行い、in vitroにおけるDNAとの結合を確認した。一方、At-AHM1あるいはAt-AHM1のAT-hookモチーフもしくは膜貫通領域を欠失させたものとGFPの融合タンパク質をタバコ培養細胞で一過的に発現させ局在を追った。結果、前者では変異のないAt-AHM1と同様の核への局在が見られたが、後者では細胞全体に融合タンパク質が存在したため、At-AHM1の核局在に対して膜貫通領域付近は重要であるがAT-hookモチーフは、重要ではないことが示唆された。
よってAt-AHM1は核内空間中にDNAを固定する機能を有するものではないかと推定した。また、本研究で用いたランダムcDNA : GFP融合法は細胞内局在タンパク質の可視化に対して極めて有用な方法であることを実証した。
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