| 研究課題/領域番号 |
12470203
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
血液内科学
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707)
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| 研究分担者 |
水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 助手 (20311938)
久米 晃啓 自治医科大学, 医学部, 助教授 (10264293)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
14,600千円 (直接経費: 14,600千円)
2001年度: 6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
2000年度: 8,200千円 (直接経費: 8,200千円)
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| キーワード | 遺伝子治療 / 遺伝子導入 / AAVベクター / パッケージング細胞株 / AAVS1領域 / Rep / ITR / TVI法 |
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| 研究概要 |
アデノ随伴ウイルス(AAV)を利用した遺伝子導入法の本格的実用化を目指し、以下の研究を行った。
1.AAVベクター作製法の開発:細胞毒性を有するAAV蛋白質の発現を新しいCre/loxP法で制御することにより、AAVベクター作製用パッケージング細胞株の開発を試みた。まず第1に、変異loxPを野生型のものと組み合わせる複合型Cre/loxP法を応用し、AAV蛋白質のRep、Capの発現を一括制御する方法を開発した。次に、RepおよびCapに対するアンチセンスmRNAを恒常的に発現させてそれぞれの発現を阻害し、必要時にCre/loxp法によってアンチセンスを抑え、Rep/Cap蛋白質の発現を誘導する新規システムを開発した。
2.AAVベクターで導入した遺伝子の高感度検出法の確立と応用:ITRのD領域に主腫のプライマーを設定してlong PCR(必要に応じてnested PCRを追加)を行い、比較的高感度で検出可能なプライマーが見出された。AAVベクターを筋注した動物の種々の臓器・組織における導入遺伝子の広がりをこの高感度検出法で検討するため、広範なサンプリングを行った。
3.AAVのコンポーネント(ITR配列とRep遺伝子)を利用した第19番染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI)法の開発:(1)AAV-ITRを連結したマーカー遺伝子とRep発現プラスミドベクターを293細胞およびK562細胞にトランスフェクションし、G418耐性となった細胞株を分離した。これらの細胞株を材料として、Alu-PCR法により遺伝子組込み部位近傍の塩基配列を決定した。その結果、ホモロジー検索でAAVS1以外に特徴的な塩基配列は見いだされなかった。(2)組込み活性を保持し、細胞毒性の減弱化した変異Rep発現ベクターについては、幾つかの候補が得られた。
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