| 研究課題/領域番号 |
12470217
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
内分泌学
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
加藤 幸雄 明治大学, 農学部, 教授 (30114177)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
14,200千円 (直接経費: 14,200千円)
2002年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
2001年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
2000年度: 7,500千円 (直接経費: 7,500千円)
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| キーワード | 下垂体 / 性腺刺激ホルモン / 転写因子 / ホメオボックス / FSH / one hybrid / クローニング / 生殖 / 生殖腺刺激ホルモン / 遺伝子 |
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| 研究概要 |
1)FSHβ遺伝子上流約800塩基領域にある107塩基対からなるFd2と名付けたDNA断片をレポーター遺伝子をもつ酵母の発現ベクターに連結したコンストラクトを構築、を酵母の染色体上に組み込んだ変異酵母をクローン化した。
2)ブタ下垂体cDNAライブラリーを転写因子GAL4の活性化部位に融合させたcDNAライブラリーを変異体酵母に導入して、cDNAの発現産物がFd2に結合能を示して得られるレポーター遺伝子の発現を指標としてクローンの選択を行い、4種の転写因子クローンを得た。
3)上記因子クローンの塩基配列を解析し、多くの転写国子に共通する特徴的なDNA結合ドメインを確認した。クローン化した因子は、酵母への再導入、組換え体タンパク質を用いて、確かにFd2に特異的に結合することを確認した。
4)下垂体由来の株化培養細胞LβT2およびモルモット由来株化細胞CHOを用いて転写因子の発現ベクターを導入して転写活性能を測定した。4種の転写因子は転写の促進、抑制に働き、いずれの因子もFSHβ鎖遺伝子に対する制御を行っていると考えらる。
5)組換え体転写因子を精製し、抗体作成にを行ったが、特異抗体の作製には至らず、新たに合成ペプチドに対する抗体作製を作成した。この抗体は、免疫に使ったウサギが自己抗体を持っていたため、やはり特異性が低く、さらに精製を行ったいる。
6)酵母の発現系を用いたタンパク質間相互作用の解析系により、すでに取得した転写因子に相互作用する新規の因子のクローニングを行い、新たな因子cLIM2をクローニングした。
7)この因子は、DNAに直接結合しない、いわゆるコリプレッサーであり下垂体のDNA結合型転写因子がコリプレッサー群を介して転写調節能を発現していることを明らかにした。
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