| 研究概要 |
ファブリー病は,α-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子変異が酵素活性の低下をもたらし,心臓などに糖セラミドが蓄積して障害を生ずる先天性代謝異常症である。同様に,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの遺伝子変異によりシンドラー病・神崎病が発症する。研究では,これらリソソーム病に関わるヒトα-ガラクトシダーゼ,その変異体とα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの三次元構造をX線結晶構造解析で明らかにし,病態の理解を深めることを目的とした。
研究では,ヒトα-ガラクトシダーゼの基質類似阻害剤デオキシガラクトノジリマイシン(DGN)との複合体のX線結晶構造解析を行った。酵素活性の低下をもたらす遺伝子変異が導入された病態酵素のタンパク質3種を発現させ,高純度試料の大量調製,結晶化,X線回折強度の測定と三次元構造の解析を行った。まず,構築した高発現系を用いて変異体を調製し,アスパラギン結合型の糖鎖を酵素処理によって均一に短糖鎖化した。調製した変異体について,分子の会合状態,活性,安定性などの性状解析を行った。DGNとの複合体のX線解析から,病気を発症する変異体2種は正常体と僅かな三次元構造差異しか示さず,酵素の安定性も低下する。致命的な古典型の変異体では,変異したアミノ酸残基の側鎖が活性部位を覆って基質の結合を妨害し,酵素の活性を完全に喪失してしまうことが判明した。
ヒトα-N-アセチルガラクトサミニダーゼについては,酵母による高発現系を構築し,精製と短糖鎖化を行い,微小ながらも結晶を得ることができた。得られた結晶の回折能を改善できれば,既に得たα-ガラクトシダーゼの結晶構造を活用する分子置換法が適用でき,直ちに三次元構造が得られることから,結晶サイズの改善を続ける計画である。
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