| 研究課題/領域番号 |
12470505
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医薬分子機能学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉浦 幸雄 京都大学, 化学研究所, 教授 (40025698)
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| 研究分担者 |
永岡 真 京都大学, 化学研究所, 助手 (60314275)
二木 史朗 京都大学, 化学研究所, 助教授 (50199402)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
16,400千円 (直接経費: 16,400千円)
2001年度: 6,000千円 (直接経費: 6,000千円)
2000年度: 10,400千円 (直接経費: 10,400千円)
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| キーワード | 転写因子 / 亜鉛フィンガー / アーキテクチャー / DNA結合 / DNA湾曲 / マルチフィンガー / 遺伝子制御 / 動力学 |
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| 研究概要 |
天然制限酵素の認識よりも広い20〜30塩基対程度の非対称配列の認識を達成するため、1つの亜鉛フィンガーモチーフ当り3塩基を認識するSp1由来のCys_2His_2型亜鉛フィンガーモチーフを6つおよび9つ導入すると共に、N末端側にDNA切断部位としてトリペプチドGGHをも導入した新規2Sp1GGHを設計・創製した。一般に大腸菌中で発現させた蛋白質のN末端はメチオニンになることが知られているので、トリペプチドGGHをN末端側に制限プロテアーゼ因子Xaの切断部位を含む形で、6つあるいは9つの亜鉛フィンガー部分のN末端に導入した。その結果、予想通り制限酵素類似の機能を示した。ショウジョウバエから単離された亜鉛フィンガー蛋白質GF2のフィンガー5は天然には珍しくAT塩基を認識している。そこで、Sp1のフィンガー2における位置にCF2のフィンガー5で見られるアミノ酸V、Y、Kをそれぞれ導入したSp1-亜鉛フィンガー変異体(Sp1VYK2)やSp1とCF2のキメラ亜鉛フィンガー蛋白質など、新しいAT認識型の亜鉛フィンガー蛋白質の分子設計を行った。得られた蛋白質を用いて、5'-GGG-TAT-GGG-3'のようなDNA配列への高選択的結合能などを評価した結果、予想通り標的DNAへの高い結合性が認められた。転写因子Sp1の3つの亜鉛フィンガードメインを基にポリグリシンで連結した新規6-亜鉛フィンガー型蛋白質を設計・創製した。その結果、4個のグリシンをリンカーとして連結させた6-亜鉛フィンガー蛋白質はDNAを湾曲化させることは出来なかったが、7個あるいは10個のグリシンをリンカーとして連結させた6-フィンガー蛋白質はDNAを大きく湾曲化させた。これらの新しい人工分子は、遺伝子機能の制御に新しい概念と手段を与えるものであり、近い将来、人工遺伝子制御分子としての開発が期待される。
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