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高度好熱菌由来酵素の低温適応変異体の解析

研究課題

研究課題/領域番号 12480184
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 構造生物化学
研究機関東京薬科大学

研究代表者

大島 泰郎  東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)

研究分担者 玉腰 雅忠  東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (10277254)
研究期間 (年度) 2000 – 2002
研究課題ステータス 完了 (2002年度)
配分額 *注記
10,200千円 (直接経費: 10,200千円)
2002年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2001年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2000年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
キーワード高度好熱菌 / 進化工学 / 低温適応 / (酵素の)耐熱性 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 実験室内進化 / 進化分子工学 / 好熱性細菌 / Directed Evolution / 熱安定酵素 / 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 反応速度論 / ランダム変異
研究概要

本研究計画は高温下に高い活性と構造安定性を持つ高度好熱菌由来の酵素を、実験室内進化により常温の環境において高い活性を発揮するように適応させると、触媒反応機構や構造安定性にどのような変化が起こるかを解析し、酵素触媒における構造安定性と触媒活性との間にどのような関係が存在するか一般則を見出すことである。モデル酵素としてロイシン生合成系の酵素であるイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を選び、実験室内進化の手法により常温適応させることを試みた。一般に高度好熱菌の生産する酵素は熱耐性が高く高温下に高い活性を示すが、常温では活性が低い。従来、証拠なしに、活性と安定性の間に取引関係があり、必然的に常温で高活性の酵素は熱安定性が劣ると考えられている。本研究計画では、好熱菌由来のIPMDHをコードするleuB遺伝子を大腸菌内で発現させ、常温でロイシンを欠く培地中でも活発に増殖するようになった変異株を選び出し、そのIPMDH活性が常温で高くなった変異体であることを確認したのち、アミノ酸配列、熱安定性、ならびに触媒機構を解析した。最初に高度好熱菌Thermus thermophilusのleuB遺伝子を用いて常温適応体を得た。その結果、常温適応酵素が必ずしも高温下における安定性を失っていないことを明らかにし、上記の「迷信」を打破した。本年度は計画通り高度好熱性古細菌S.tokodaiiのleuBを用いて実験室内進化に成功し、常温適応体を得た。また、大方の予想に反し、変異部位は触媒中心に見られないことが多く、しばしば触媒中心から遠いことか多いということも明らかにした。反応の機構を解析し、これらの常温適応体は、kcatが改善されたものと、Kmが改善されたものがあることも分かった。以上を総合して以下の二つの結論が引き出せる。1 酵素触媒の安定性と触媒効率の間には取引関係かない。2 酵素の機能を改善するには活性中心残基を置換する必要がない。

報告書

(4件)
  • 2002 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2001 実績報告書
  • 2000 実績報告書
  • 研究成果

    (28件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (28件)

  • [文献書誌] M.Ishida, et al.: "Overexpression in Escherichia coli of the AT-rich trpA and trpB genes from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus."FEMS Microbiol.Letters. 216. 179-183 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.ISHIDA, T.OSHIMA: "Effective Structure of a Leader Open Reading Frame for Enhancing the Expression of GC-Rich Genes."J.Biochem.. 132(1). 63-70 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] C.Motono, et al.: "High thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus resulting from low deltaCp of unfolding."Protein Eng.. 14(12). 961-966 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Analysis of the effect of accumulation of amino acid replacements on activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus."Protein Eng.. 14(8). 601-607 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Cold Adaptation of the Thermophile Enzyme 3-Isopropylmalate Dehydrogenase."J.Biochem.. 129(3). 477-484 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Tamakoshi, et al.: "Selection of stabilized 3-isopropylmalate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae using host-vector system of an extreme thermophile, Thermus thermophilus."Extremophiles. 5. 17-22 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Ishida, et al.: "Overexpression in Escherichia coli' of the AT-rich trpA and trpB genes from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus"FEMS Microbiol.Letters. 216. 179-183 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.ISHIDA, T.OSHIMA: "Effective Structure of a Leader Open Reading Frame for Enhancing the Expression of GC-Rich Genes"J.Biochem.. 132(1). 63-70 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] C.Motono, et al.: "High thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus resulting from low deltaCp of unfolding"Protein Eng.. 14(12). 961-966 (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Analysis of the effect of accumulation of amino acid replacements on activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Therinus thermophilus"Protein Eng.. 14(8). 601-607 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Cold Adaptation of the Thermophile Enzyme 3-Isopropylmalate Dehydrogenase"J.Biochem.. 129(3). 477-484 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Tamakoshi, et al.: "Selection of stabilized 3-isopropylmalate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae using host-vector system of an extreme thermophile, Thermus thermophilus"Extremophiles. 5. 17-22 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Ishida, et al.: "Overexpression in Escherichia coil of the AT-rich trpA and trpB genes from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus"FEMS Microbiol. Letters. 216. 179-183 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] M.ISHIDA, T.OSHIMA: "Effective Structure of a Leader Open Reading Frame for Enhancing the Expression of GC-Rich Genes"J. Biochem.. 132(1). 63-70 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] T.Suzuki, et al.: "Sulfolobus tokodaii sp. nov. (f. Sulfolobus sp. strain 7), a new member of the Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan"Extremophiles. 6(1). 39-44 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] C.Motono, et al.: "High thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus resulting from low deltaCp of unfolding"Protein Eng.. 14(12). 961-966 (2001)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Analysis of the effect of accumulation of amino acid replacements on activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus"Protein Eng.. 14(8). 601-607 (2001)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Cold Adaptation of the Thermophile Enzyme 3-Isopropylmalate Dehydrogenase"J. Biochem.. 129(3). 477-484 (2001)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Toshiharu Suzuki et al.: "Sulfolobus tokodaii sp. nov.(f.Sulfolobus sp. strain 7), a new member of the Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan"Extremophiles. 6(1). 39-44 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Yutaka kawarabayasi et al.: "Complete Genome Sequence of an Aerobic Thermoacidophilic Crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain 7"DNA Research. 8(4). 123-140 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Raita Hirose et al.: "Crystal structures of mutants of Thermus thermophile IPMDH adapted to low temperatures"Protein Eng.,. 14(2). 81-84 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Toshiharu Suzuki et al.: "Adaptation of a thermophilic enzyme, 3-isopropylmalate dehydrogenase, to low temperatures"Protein Eng.,. 14(2). 85-91 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Y.Hayashi-Iwasaki et al: "Purification and characterization of Recombinant 3-Isopropylmalate Dehydrogenases from Thermus thermophilus and Other Microorganisms."In "Methods in Enzymology" (eds.By RA.Harris,JR.Sokatch). 324. 301-322 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] H.Hori et al.,: "Identification of Thermus thermophilus HB8 tRNA(Gm18)methyltransferase gene."Nucleic Acid Symp.. Ser44. 167-168 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] N.Tanaka and T.Oshima: "Structure and Thermostability of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase."Protein Peptide Letters,. 7[5]. 333-340 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] T.Hori et al.,: "The initial step of the therma1 unfolding of 3-isopropylmalate dehydrogenase detected by the temperature-jump Laue method."Protein Engng.. 13[8]. 527-533 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] Z.NURACHMAN et al.,: "Crystal structures of 3-isopropylmalate dehydrogenases with mutations at the C-terminus : Crystallographic analyses of structure-stability relationships"Protein Engng.. 13[4]. 253-258 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] 大島泰郎: "高度好熱菌から学ぶ"第14回大学と科学シンポジウム「生物の働きを生み出すタンパク質のかたち」. 172-182 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書

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公開日: 2000-04-01   更新日: 2016-04-21  

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