| 研究課題/領域番号 |
12555238
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
工業分析化学
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| 研究機関 | 有明工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
正留 隆 有明工業高等専門学校, 物質工学科, 助教授 (30190341)
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| 研究分担者 |
田部井 久男 NTTアドバンステクノロジ株式会社, 先端基盤技術事業本部・デバイス技術部材料部門, 部門長
今任 稔彦 九州大学, 大学院・工学研究院・化学システム工学専攻, 教授 (50117066)
浅野 泰一 八戸工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (80311108)
黒川 陽一 福岡県保健環境研究所, 管理部・環境計測課, 専門研究員
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
11,000千円 (直接経費: 11,000千円)
2002年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2001年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2000年度: 5,900千円 (直接経費: 5,900千円)
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| キーワード | 内分泌かく乱物質 / シークエンシャルインジェクション / ビテロジェニン / 固相抽出 / 化学発光法 / 免疫測定法 / protein A / マイクロビーズ / 酵素免疫法 / 抗原抗体反応 |
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| 研究概要 |
1.擬似エストロジェン作用を示す内分泌撹乱物質は、生物の生殖や健康に深刻な影響を及ぼす。ビテロジェニン(V_g)は本来雌の魚類血中に特異的に発現するタンパク質であるが、環境水の内分泌撹乱物質汚染により、雄にも発現するようになることが知られている。従って、雄の魚類血中におけるVgの存在は、環境水の内分泌撹乱汚染状況に対する重要な指標となる。本研究では、Vg測定法の簡便化及び迅速化を目的とし、抗体固定化磁性マイクロビーズを用いるフロー免疫測定法について検討した。
2.本法のフロー系は、シリンジポンプ、ホールディングコイル、バルブ、化学発光検出器からなる。磁性ビーズにはFe_2O_3をAgarose gelで被覆したものを用いた。抗体の固定化は、ビーズ表面のヒドロキシル基をエポキシ化したのち、これと抗体のアミノ基とをカップリングすることにより行った。この抗体固定化磁性ビーズを、作製したセルに導入し、サマリウム磁石で捕捉した。トリス緩衝液で十分潅流した後、Vg試料、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体を順次導入した。最後にルミノール/H_2O_2溶液を導入し、このとき化学発光する光強度を光電子増倍管により測定した。
3.磁性ビーズは、濃度250μg/mLの懸濁液300μLを流量5μL/sのキャリヤー液でセルに導入することにより、再現よく検出部に捕捉できることがわかった。フロー系の最適化を行うことによって得られたVgの検量線は、Vg濃度50ppb以上では、プラトーとなっている。これは抗体固定化にアミノ基を会しているために、抗体の抗原結合部位の失活や不適な配向性のために、ビーズ表面の活性な固定化抗体密度が低いことが原因と推測される。本法では2〜50ppbの濃度範囲でVgの測定が可能である。4時間程度の測定時間を要する従来のマイクロプレート法と比べ、反応中の溶液の振とうが可能であり、ビーズの1粒子(100μm)が通過できる程度の流路において反応を効率的に行うことができるため、同程度の感度ながら測定時間を1時間に短縮できた。
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