| 研究課題/領域番号 |
12556057
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
応用獣医学
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
鈴木 達行 山口大学, 農学部, 教授 (00216409)
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| 研究分担者 |
音井 威重 山口大学, 農学部, 助教授 (30311814)
藤原 昇 九州大学, 農学部, 教授 (60150512)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
8,200千円 (直接経費: 8,200千円)
2002年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2001年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2000年度: 4,700千円 (直接経費: 4,700千円)
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| キーワード | EGFP遺伝子 / 牛 / リポゾーム / 遺伝子導入核 / 除核卵子 / 核構築胚 / 移植 / 遺伝子発現 / EGFPcDNA / 体細胞 / クローン / リポフェクション / 遺伝子導入 / 陰圧式培養器 / クローン子牛の作出 / マイクロインジェクション / 蛍光発現 / エレクトロポーレーション / モザイク / 精子 / 牛初期胚 / ブラストメアー |
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| 研究概要 |
-20Cで3ヶ月間凍結保存後、融解した牛胎児細胞からドナー核を作り出した。セルラインの7回から12回継代培養したものを本研究のドナー核として用いた。これらのドナー核にオワンクラゲ蛍光遺伝子、EGFPジーンフラグメントをリポゾームの媒介により牛胎児細胞内へ取り込んだ。牛胎児細胞は遺伝子導入前に4〜5日間飢餓状態に置くため、牛血清添加量を抑えた0.5%血清加DMEM培地内で順化させた。一方、除核卵子を準備するため、食肉処理場で得られた卵丘付き卵母細胞を修正卵管液で成熟培養し、20〜22時間後に5ug/mlサイトカラシンB+0.3%BSA加修正SOF液内で除核し、ドナー核を挿入して電気融合装置BTX2001によりDCパルス1kv/cm, 50マイクロ秒にてチマーマン液内で融合した。その後修正SOF液内で8日間培養し、発生した胚盤胞、拡張・脱出した胚盤胞への遺伝子導入成果を確認した。その結果、胚全体に遺伝子が導入されたものは11例(3.5%)で、このうち胚盤胞は1例(1.0%)に過ぎなかった。遺伝子導入例の大部分がモザイク状で26例(8.4%)にみられた。遺伝子導入核構築胚の一部は開発した陰圧式炭酸ガス培養器で培養しながら、日本(福岡)から中国(チンタオ)空港を経て、中国莱陽農業大学で準備した5頭の受胚牛へ移植実験を試みた。その結果、3頭が妊娠し、1頭は移植後60日後に流産、2頭が分娩した。これらの分娩牛からの遺伝子導入成功の有無については未だ確認されていない。
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