| 研究課題/領域番号 |
12557005
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
環境生理学(含体力医学・栄養生理学)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
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| 研究分担者 |
近江谷 克裕 独立行政法人, 産業技術総合研究所, 主任研究員 (20223951)
白川 哲夫 北海道大学, 大学院・歯学研究科附属病院, 講師 (00187527)
安倍 博 北海道大学, 大学院・医学研究科, 講師 (80201896)
久保田 英博 アトー株式会社, 技術開発部・学術研究課, 課長(研究職)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
12,500千円 (直接経費: 12,500千円)
2001年度: 5,500千円 (直接経費: 5,500千円)
2000年度: 7,000千円 (直接経費: 7,000千円)
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| キーワード | 生物発光 / マルチレポータシステム / 遺伝子導入 / ルシフェラーゼ / 転写因子 / 時計遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究は、複数の発光レポータ遺伝子を細胞に導入し遺伝子発現を分別測光することにより、多数の遺伝子発現を同時に計測し、多点解析を可能とすることにある。研究は、以下の3点に分けて行われた。
(1)多色レポータ遺伝子cDNAクローニングとレポータベクターの構築:分別可能な発光特性をもつレポータ遺伝子を組み合わせ、ベクターを構築すると同時に、蛋白の半減期延長による発光効率の増大、新規発光酵素のクローニングを行った。赤色と緑色領域の発色波長をもつ2種の鉄道虫ルシフェラーゼのcDNAを同一ベクターに組み込み、異なるプロモータにより発現を調節し、NIH3T3細胞に導入して安定発現株を作成し、発光を確認した。しかし、鉄道虫蛋白は哺乳類細胞での発光が微弱であり、10^6以上の細胞数が必要なことが分かった。そこで、哺乳類細胞でも強力な発光が得られるホタルとウミボタルルシフェラーゼによる同時モニタリングをGH3細胞を用い行った。その結果、両者は生細胞で分別測光可能であり、リアルタイムで2遺伝子発現の同時モニタリングが可能となった。
(2)微量分別測光系の開発:赤色あるいは緑色発光波長をもつ鉄道虫ルシフェラーゼの強制発現ベクターを導入した赤色と緑色発光大腸菌コロニーを用い微量分別測光系の構築を行った。暗箱内を37度に維持し、35mmグラスボトムシャーレを6個載せたターンテーブルが冷却CCDカメラ上を回転し、細胞内発光をルミノキャプチャー、液晶フィルターを介して連続分別測光するシステムを構築した。
(3)プロモータ配列の解析と細胞内連続測定系の構築:時計遺伝子Per1とBMAL1のプロモータ領域を解析し、ホタルルシフェラーゼにて細胞内発現強度を検討した後、両プロモータの下流にGFP,ホタルルシフェラーゼ,ウミボタルルシフェラーゼを組み込んだベクターを構築した。これらの遺伝子発現をモニターするトランスジェニックマウスを現在作成中であり、今後交配により、同時モニタリング可能となる。
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