| 研究概要 |
園芸作物のエチレン誘導-脱緑・黄化(クロロフィル代謝)に関与する酵素類を単離・精製.クロロフィル(Chl)代謝のTypeI反応に関与する酵素としてChlorophyllase以外にC-132^2-カルボキシルピロフェオフォルビドαを生成する酵素(CPFE)をウンシュウミカン果皮・ブロッコリー花らいより単離・精製を行った.Chl代謝の「Key」酵秦であるchlorophyllase遺伝子(CHL)をミカン果皮・トマト果皮・カイワレダイコン子葉・シロイヌナズナ葉・ピーマン果皮より単離.また,シロイヌナズナ葉・トマト果皮よりChl bリダクターゼ遺伝子を単離.Cu-CHLのdelation実験により機能的構造解析を行なった.C末端の21塩基(7アミノ酸)欠損では酵素活性に影響はなく,それ以上の欠損・リパーゼモチーフのセリン残基を欠損・変異を行なった場合ではChlorophyllase活性を示さなかった.Cu-CHLのC末端領域の3次構造の重要性を確認.
また,切り花の鮮度・品質保持の評価技術を開発した.輪ギクの葉の黄化機構を,脱緑関連酵素の特定と遺伝子単離・エチレン感受性等遺伝子(ERS)の発現解析で明らかにし,黄化抑制技術を開発した.スィートピー花弁よりLoADPX(アントシアニン分解酵素)を単離・RT-PCR・ノーザン解析の結果,STS-誘導LoADPX 1の発現はシクロヘキシミドで顕著に阻害された.老化中にアポトーシス制御遺伝子Bcl2様遺伝子mRNA発現量の変化を確認.LoDad1(アポトーシス細胞死抑制遺伝子)を単離.そのmRNA発現量は構成的であり,老化兆候に伴いその遺伝子の発現レベルは完全に抑制され,STS/糖処理により,LoDad1のmRNA遺伝子の発現レベルは一過性的に増大・構成的レベルで維持した.トマト果実においてもポリフィリン代謝関連遺伝子(HO1,ADPX)・LeDad1の発現が糖により制御されていた.さらに,花弁の老化過程の進行につれアポトーシスの生化学的特徴(クロマチンの凝縮・核の断片化・DNAのラダー化)を観察.ラダー化機構の因子であるヌクレアーゼ・老化因子のシステインプロテアーゼ(LoCyPとする)を単離.老化に伴いLoCyPの発現が誘導・転写レベルが増大した.その発現レベルはSTS/糖処理・雌蕊除去処理で阻害され,STS/糖類による加齢・アポトーシス制御作用とDad1の育種技術への可能性が示唆された.トマトのアポトーシス現象前には,BR-様Chl開環産物を含めた生理機能性物質の生成を確認し,その過程中,ヒト胃がん細胞の増殖抑制能を有する機能性物質の存在を明らかにした.
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