ヒトチューブリン発現酵母の構築及びチューブリンと微小管作用薬との相互作用解析

• 研究課題/領域番号: 12660092
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 理化学研究所
• 研究代表者: 臼井 健郎 理研, 研究員 (60281648)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2002年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 2001年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2000年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: ヒトチューブリン蛋白質 / 出芽酵母 / 発現系

研究概要

微小管作用薬の作用領域を同定する目的でチューブリン遺伝子のキメラ遺伝子の作成を試みた。現在知られている薬剤のほとんどがβチューブリンを標的としていることからヒトβチューブリン遺伝子と出芽酵母βチューブリン遺伝子(TUB2)のキメラ遺伝子の作成を行った。キメラ遺伝子作成の為、それぞれの相同な部異に制限酵素サイトを導入し、8ケ所で組み替えが可能なそれぞれのチューブリン遺伝子を作成した。また酵母への導入を確認するためにC末終止コドンの後ろにHIS3マーカーを導入し、チューブリンカセットを作成した。現在発現したチューブリンタンパク質の確認を容易にするためにHAタグの導入を行っている。
また遺伝子を導入する酵母としてゲノムのチューブリン遺伝子を破壊し、URA3マーカーのシングルコピーベクターで酵母チューブリン遺伝子を持たせたチューブリンシャッフル株を作成した。現在作成したシャッフル株にチューブリンカセットを導入し株の作成を行っており、導入確認後、5-FOAによるベクター除去を試み、ヒトチューブリン遺伝子発現酵母の作成を行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Sano T, et al.: "Isolation of new protein phoshatase inhibitors from two cyanobacteria species, Planktothrix spp."J Nat Prod. 64. 1052-1055 (2001)
• [文献書誌] Sodeoka M, et al.: "Synthesis of a tetronic acid library focused on inhibitors of tyrosine and dual-specificity protein phosphatases and uits evaluation regarding VHR and cdc25B inhibition."J Med Chem.. 44. 3216-3222 (2001)
• [文献書誌] Usui T, et al.: "Design and synthesis of a dimeric derivative of RK-682 with increased inhibitory activity against VHR, a dual-specificity ERK phosphatase : implications for the molecular mechanism of the inhibition."Chem Biol.. 8. 1209-1220 (2001)
• [文献書誌] Usui T, Schiebel E.: "Regulating microtubule properties by modifying their organizing minus ends."Mol Cell. 8. 931-932 (2001)
• [文献書誌] J.F.Sans-Cevera, et al: "Synthesis and evaluation of microtubule assembly inhibition and cytotoxic of prenylated derivatives of cyclo-L-Trp-L-Pro."Bioorg.Med.Chem.. 8. 2407-2415 (2000)
• [文献書誌] H.Wang, et al: "Synthesis and evaluation of tryprostatin B and demethoxyfumitremorgin C analogs."J.Med.Chem.. 43. 1577-1585 (2000)
• [文献書誌] H.Watanabe, et al: "Synthesis of pironetin and related analogs : studies on structure-activity relationships as tubulin assembly inhibitors."J.Antibiot.. 53. 540-545 (2000)
• [文献書誌] 長田裕之 他: "微小管機能に関与する蛋白質とその低分子阻害剤"バイオサイエンスとインダストリー. 58. 789-792 (2000)
• [文献書誌] 臼井健郎 & 長田裕之: "微小管に作用するアルカロイド化合物 新しい微小管作用薬開発のリード化合物としての可能性"化学と生物. 39. 79-81 (2001)