| 研究課題/領域番号 |
12660093
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 宇都宮大学 (2001)
理化学研究所 (2000) |
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研究代表者 |
遠藤 勲 宇都宮大学, 農学部・生物生産科学科, 教授 (00087470)
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| 研究分担者 |
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
尾高 雅文 理化学研究所, バイオ工学研究室, 先任研究員 (20224248)
上田 俊策 宇都宮大学, 農学部・生物生産科学科, 助教授 (80160167)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2001年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2000年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | システインスルフェン酸 / システインスルフィン酸 / 非ヘム鉄蛋白質 / 翻訳後修飾 / ニトリルヒドラターゼ / 金属シャペロン / システイン酸化体 / 非ヘム鉄タンパク質 / 金属タンパク質特異的シャペロン |
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| 研究概要 |
ニトリルヒドラターゼ(NHase)は、システイン酸化体を配位子とする新規な非ヘム鉄または非コリンコバルト酵素である。申請者らは鉄型NHase遺伝子下流に存在するORFがこの酵素の組換え体発現に必須なNHase活性化蛋白質であることを見出した。同様にコバルト型NHaseにおいても活性化蛋白質遺伝子が報告されている。そこで、本研究課題では、NHase活性化蛋白質の構造と機能を明らかにすることを研究目的とし、以下の研究を行った。
1.NHase活性化蛋白質とNHaseとの相互作用 NHase活性化蛋白質における金属結合部位を予想されるモチーフ^<73>CXC^<77>Cの一つまたは全てのシステイン残基をセリンに置換した変異体を作製し、NHase発現ベクターをともに大腸菌によって共発現させた。その結果、得られた大腸菌粗抽出液のNHase活性はいずれも野生型の場合の15%以下になった。このモチーフはこれまでに報告された金属シヤペロンにも保存されており、NHase活性化蛋白質はNHaseへの鉄イオンの挿入に関与することが示唆された。His-tagを結合させたNHase活性化蛋白質をNHaseα、βサブユニットと共発現させ、Ni-NTAカラムに吸着させたところ、NHaseα、βサブユニットの両方ともNHase活性化蛋白質と共に溶出した。この結果は、NHase活性化蛋白質がNHaseα、βサブユニットと相互作用をすることを直接示した初めての成果である。
2.NHaseファミリーに属する他の酵素に関する研究 鉄型NHaseに見られる翻訳後修飾はコバルト型NHaseおよびNHaseと高い相同制をもつチオシアネート加水分解酵素にも保存されていることを明らかにした。また、チオシアネート加水分解酵素遺伝子のオペロンからは同様な活性化蛋白質遺伝子は同定されていない。同酵素構造遺伝子のみを含む発現ベクターを大腸菌に導入したところ、金属も修飾も含まないアポ型と思われる蛋白質が得られた。NHaseファミリーにおける金属の挿入や修飾形成機構は酵素によって様々な方法で行われるのかも知れない。
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