| 研究課題/領域番号 |
12660261
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用動物科学
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
佐伯 和弘 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (10298937)
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| 研究分担者 |
松本 和也 近畿大学, 生物理工学部, 助教授 (20298938)
細井 美彦 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (70192739)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2001年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | TGF8 / ウシ / 胚 / クローン / トランスフェクション / 体細胞 |
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| 研究概要 |
キメラDNA/RNAオリゴヌクレオチドを用いてTransfoming growth factor 8 (TGF8)遺伝子を破壊し筋肉を増大したウシを作製すること最終目的に下記の研究を行った。1)遺伝子を導入する培養細胞の状態によって導入遺伝子の発現に影響するかどうか調べるため、ウシ繊維芽細胞と卵丘細胞を異なる細胞周期において、DNAインジェクション法を用いてpβ-act/luc+の発現検出時期の検討を試みた。その結果、マーカー遺伝子の発現を指標とした細胞への遺伝子導入は、培養細胞がconfluent状態の時に行うこと、そして遺伝子導入細胞の発現の検討はクローン胚作製に先立つ体細胞の血清飢餓処理の前に行うことが好ましいと思われた。また、DNAを培養細胞に効率よく導入する方法を検討するため、ウシ体細胞にインジェクション法、エレクトロポレーション法および試薬による遺伝子導入法を用いpβact/luc+/IRES/EGFP遺伝子を導入し、その発現をEGFP蛍光で観察し、それぞれの方法における導入効率を調べた。その結果、ウシ線維芽細胞への遺伝子導入は導入試薬を用いた方法で導入効率が高かった。さらに、導入試薬を用いて遺伝子導入した細胞では、G418での選択培養後もEGFP発現が観察されその後核移植胚でも発現が見られているので、stableに導入遺伝子が発現していると考えられた。このことから、ウシ線維芽細胞に効率的に遺伝子導入を行うには、導入試薬を用いた方法が適切であることが示唆された。2)酵母の細胞質リボソームタンパク質であるL29をコードする遺伝子cyh2に点変異が起こるとシクロヘキシミド耐性になることをもとにして、L29に相同性のある哺乳類の細胞質リボソームタンパク質L27の遺伝子をキメラ形成法を用いて、マウスおよびウシ線維芽細胞に変異を導入し、シクロヘキシミド耐性細胞の獲得を検討した。また、選択培養後、生存していた細胞のL27遺伝子における点変異を確認するため遺伝的解析を行った。その結果、変異を誘起した細胞のみが選択培養10日後でもシクロヘキシミド下で生存した。3)キメラ形成法を利用したノックアウト動物作出方法の検討として、double-muscleウシのGDF8遺伝子の点変異に注目し、そのキメラオリゴヌクレオチドのデザインを検討した。
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