| 研究課題/領域番号 |
12670242
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
寄生虫学(含医用動物学)
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
橘 裕司 東海大学, 医学部, 助教授 (10147168)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2001年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2000年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | 赤痢アメーバ / ヒトモノクローナル抗体 / レクチン / 無症候性嚢子排出者 / 抗体遺伝子 |
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| 研究概要 |
赤痢アメーバに感染していながら症状を呈さない無症候性嚢子排出者は、有症者ほど高い抗体価を示さないものの、赤痢アメーバの腸粘膜への侵襲を防御できる抗体を保有している可能性が高い。そこで、無症候性嚢子排出肴の末梢リンパ球由来の抗体遺伝子ライブラリーを構築し、抗赤痢アメーバヒトモノクローナル抗体Fab断片の作製を試みた。末梢血液約10mlからリンパ球を分離してRNAを精製し、抗体のL鎖とH鎖Fd領域をコードする遺伝子を増幅した。これらの遺伝子断片を発現ペクターに組み込んで大腸菌に導入し、ライプラリーを構築した。コロニーブロット法でスクリーニングを行い、次に間接蛍光抗体法で虫体表面と反応する1クローン(CP33)を選別した。さらに、CP33のH鎖に別のL鎖を組み合わせた3クローンを選別した。これら4クローンはいずれも260-kDaGal/GalNAcレクチンのcysteine-rich domainを認識していた。そして、これらの抗体で赤痢アメーバ栄養型虫体を前処理してCHO細胞と反応させたところ、接着が有意に抑制された。同様にこれらの抗体で前処理した虫体では赤血球貧食能が有意に抑制された。このように、抗体価が低い無症侯性嚢子排出者の僅かな本梢血液からでも、接着中和活性のあるヒト抗体を効率よく作製することができた。また、このようなヒト抗体をアメーバ症の診断にも応用するため、H鎖遺伝子のクローニング部位の下流にアルカリフォスファターゼ遺伝子を組み込んだベクターを構築し、抗体をアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質として産生させることを検討した。その結果、酵素活性を保持した状態で融合蛋白質を精製することができた。組換え型抗体として産生させることで、簡便に均質な標識ヒト抗体の調製が可能になると考えられた。
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