| 研究課題/領域番号 |
12670263
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 中京女子大学 |
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研究代表者 |
小塚 諭 中京女子大学, 健康科学部, 助教授 (40117817)
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| 研究分担者 |
信沢 枝里 名古屋市立大学, 医学部, 助教授 (90183904)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2001年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2000年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | 百日咳 / 遺伝子組み換え / ワクチン / 経鼻投与 / 粘膜アジュバント / PTA / rCTB / rLTB / 百日咳ワクチン / 経鼻接種 / 粘膜ワクチン / アジュバント / CTB / LTB / 無毒化PTA |
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| 研究概要 |
経鼻接種が可能な遺伝子組み換え無毒化百日咳毒素Aサブユニット(PTA:9K/129G)ワクチンの作製を目的として、Bacillus brevisでの発現と分泌を試みた。まず百日咳菌東浜株のPTA(S1)遺伝子をLA PCR in vitro Mutagenesis法によりPTAの9Rが9Kに、また129Eが129Gになるようにそれぞれのmutant用primerを作製しPCRを行った。これを制限酵素で切り出し、プラスミドベクターpUC19にクローニングし、シークエンスを確認したところ、予想通り目的の遺伝子に置換がおこっていることを確認した。次いで同様の制限酵素で切り出した後、pNU212にライゲーションし、エレクトロンポーレーション法によりB.brevisの高効率大量発現株(HPD31)に遺伝子導入した。エリスロマイシン含有T2培地でインサート導入株を選択し、抗PT抗体を用いたcolony immuno blot法により組換え無毒化PTAを大量に発現・分泌する株を10数株選択した。これを5PY培地で培養し、その産生量を検討したところ、30℃での振とう培養5日後に、数十ミリグラム/Lのタンパク質を発現・分泌する株を得ることができた。
また我々は、経鼻投与に必要な粘膜アジュバントとして、遺伝子組み換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)や、腸管毒素原性大腸菌の易熱性毒素(rLTB)をBacillus brevisの高効率大量発現・分泌系を用いて組換え作製し、そのアジュバント効果を調べた。その結果rCTBやrLTBは経鼻投与で一緒に投与した抗原の血中IgG抗体価のみならず、肺、鼻腔、膣、腸管などの粘膜面におけるIgA抗体価を上昇ることが明らかとなった。
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