| 研究課題/領域番号 |
12670590
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
神経内科学
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
玉岡 晃 筑波大学, 臨床医学系, 助教授 (50192183)
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| 研究分担者 |
望月 昭英 筑波大学, 臨床医学系, 講師 (40301080)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
2002年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2001年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2000年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | アルツハイマー病 / アミロイドB蛋白 / BACE1 / APP / アミロイドβ蛋白 / BACE-1 / BACE / 神経細胞 / 星状グリア細胞 / βアミロイド前駆体蛋白 / ELISA |
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| 研究概要 |
本研究では、ウサギ抗ヒトBACE1ポリクローナル抗体を作成し、その特異性をウエスタンブロット法にて検証した後、ヒト脳の連続抽出画分におけるBACE1の同定と定量を行なうとともに、ヒト脳組織におけるBACE1の免疫染色性の分布を明らかにすることを目的とした。方法:BACE1の全長DNAをヒト脳ライブラリーからクローニングし、pcDNA3に挿入することによって、pcDNA3-hBACE1を作成した。次にこのコンストラクトをHeLa細胞に一過性に強制発現させ、細胞回収後その膜画分を抽出し、これをヒトBACE1のポジティブコントロールとした。抗BACE1-N(BACE1の46～56を認識)抗体および抗BACE1-C(BACE1の485～501を認識)抗体を作成し、抗体の特異性を検証するために、感度、特異度がわかっている既製の抗BACE1抗体を用いて比較検討した。対象試料としてはアルツハイマー病(AD)やヒト対照凍結脳の海馬を含む側頭葉を用いた。各サンプルは3倍容量のバッファーにてホモジェナイズしたのち10万Xgにて遠心後に上清を分離した。バッファーとしては、タンパク分解酵素阻害剤を加えたTSE、1%Triton-X/TSE、0.5%SDS/TSEを用いて連続抽出を行なった。また、0.5%SDS/TSEにて直接抽出した上清の採取も行なった。各サンプルは蛋白量を一致させ、各種抗体(抗BACE1抗体、抗GFAP抗体、抗MAP2抗体)によるウエスタンブロットを同時に行ない、目的蛋白をdensitometerで定量した。BACE1の脱糖鎖反応による変化も検討した。免疫組織化学では、ヒト脳薄切切片に各抗BACE1抗体を用い、DAB法にて染色した。結果:抗BACE1-N抗体、抗BACE1-C抗体はBACE1を同定でき、BACE1は全抽出画分に回収されていた。0.5%SDS/TSEにて直接抽出した画分中のBACE1/MAP2は正常対照群と比較してAD群にて有意に増加していた。また、ヒト脳の免疫組織染色では神経細胞体が主に染色されていた。以上の所見より、神経細胞あたりのBACE1発現量はAD脳において増加していることが明らかとなり、これはADにおける神経細胞あたりのAβ産生増加を示唆するものと考えられた。また、ヒト脳には糖鎖の付加した成熟型BACE1と付加前のBACE1が含まれることも示された。
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