| 研究課題/領域番号 |
12670772
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
中 宏之 奈良県立医科大学, 小児科学教室, 助手 (40281761)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2002年度: 100千円 (直接経費: 100千円)
2001年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2000年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
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| キーワード | 血友病A / 遺伝子治療 / アデノウィルス / レンチウィルス / アデノウィルスベクター / レンチウィルスベクター |
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| 研究概要 |
現在までに作製した組換えウィルスは1)CMVプロモーター制御下にBドメインを欠失したイヌ第VIII因子cDNAを組み込んだ第1世代アデノウィルス(Adeno/cFVIIIdelB)、2)CMVプロモーター制御下にクラゲGFP cDNAを組み込んだ第3世代レンチウィルス(Lenti/CMV-GFP)、3)肝細胞特異的プロモーター制にBドメインを欠失したイヌ第VIII因子cDNAを組み込んだ第3世代レンチウィルス(Lenti/HS-cFVIIIdelB)の3種類である。これらの組換えウィルスを用いて、種々の培養細胞系でのIn vitro実験と通常のマウスでのIn vivo実験でそれぞれの発現を検討した。Adeno/cFVIIIdelBを用いたIn vitroの結果は昨年報告した。第VIII因子ノックアウトに10^*9pfu程度のAdeno/cFVIIIdelBを尾静脈より静脈内投与し、1w、2w、4w後に眼窩静脈叢から採血し第VIII因子抗原をELISA法、第VIII因子活性を凝固一段法で測定した。1w、2w後の結果では5-7%のイヌ第III因子抗原を認めたが、4w後にはdetectできなかった。これは導入・発現した第VIII因子に対する同種抗体が原因であった。3.0x10^*8TUの組換えウィルスLenti/CMV-GF種々の方法(静脈内・腹腔内・経門脈・直接肝臓)で、通常のマウスに投与し、1週間後屠殺し肝臓の凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡で観察した。経門脈で最も効率的に導入したGFP蛋白の発現が確認できた。3.0x10^*8TUの組換えウィルスLenti/HS-cFVIIIdelBを、経門脈的に第VIII因子ノックアウトマウスに導入し、8週目まで毎週眼窩静脈叢から採血し第VIII因子抗原と活性を測定した。第2週には最高値で第VIII因子抗原で3.4%、活性で33%であった。8週目まで抗原・活性値は1-2%を持続し、同種抗体の出現はみとめなかった。
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