Von Willebrand因子・血小板相互作用の制御機構の解析

• 研究課題/領域番号: 12670983
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 血液内科学
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 松下 正 名古屋大学, 医学部・附属病院, 助手 (30314008)
• 研究分担者: 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2001
• 研究課題ステータス: 完了 (2001年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2001年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2000年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: von Willebrand factor / GPIb / Polvmerase chain reaction / platelet / thrombosis / coronay heart disease / alanine scanning mutagenesis / Polymerase chain reaction / von Willebrand因子 / ristocetin / botrocetin / mutant / 血小板

研究概要

本研究ではvon Willebrand因子(以下VWF)と血小板膜糖蛋白GPIbの結合におけるVWFのコンフォメーション変化の本体を明らかにすることにより、血栓症発症のメカニズム、さらにはコントロール・治療に結びつく知見を得ようとした。まず平成12年度はFlanking regionの各領域、459-508,475-508,.497-508,696-709,459-508+696-709,475-508+696-709,497-508+696-709を欠失させたmutantをPCR法を応用して作成した。発現プラスミドを293T細胞に発現させ、良好な発現を得た。Mutantが正しい蛋白コンフォメーションをとっているかどうかをモノクローナル抗体パネルを確認した。以上の後平成13年度においてmutant蛋白質のGPlbへの結合能を、ristocetinおよびbotrocetinの存在下で検討、併せてモジュレーター非存在下での結合を検討した。497-508、696-709を欠損したものとR545のDouble mutantでは興味深いことに通常見られないモジュレーター非存在下での結合が出現した。以上のことより、VWF-GPlb反応の制御は、S-S結合ループ外側の領域とType 2B領域との協調により成立していると考えられた。次にこの結合に対して抗VWF抗体NMC4,Avw3が阻害を示し、結合がGPlb依存性のものであることを確認した。さらにFlanking regionの一部である505-506と539-543にエピトープを持つ3つの抗VWF抗体B328,B710,23C4の、696-709欠損Double mutantに対する阻害能が確認できた。Emsleyらによる1998年に発表されたhuman VWFの結品構造モデルを用いて解析したところこれらの抗体はN末端armのcornerに結合することによってVWFのコンフォメーション変化にロックをかけていると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] T.Sugihara., I.Takahashi., T.Matsushita., et al.: "Identificaion of plasma antibody epitopes and gene abnormalities in Japanese hemophilia A patients with factor VIII inhibitor"Nagoya J Med Sci.. 63. 25-39 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Nakayama., T.Matsushita., et al.: "A case of purpura fuiminans is caused by hornozygous delta8857 mutation (protein C-nagoya) and successfully treated with activated protein C concentrate"Br J Haematol. 110. 727-730 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Matsushita., D.Meyer., J.E.Sadler: "Localization of von Willebrand Factor-binding Sites for Platelet Glycoprotein lb and Botrocetin by Charged-to-Alanine Scanning Mutagenesis"J. Biol. Chem.. 275. 11044-11049 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] A.Katsumi., T.Matsushita., et al.: "Severe factor VII deficiency caused by a novel mutation His348 to Gin in the catalytic domain"Thromb Hacmost. 83. 239-243 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Ishiguro., T.Matsushita. et al.: "Complete antithrombin deficiency in mice results in embryonic lethality"J Clin Invest. 106. 873-878 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakayama Y., Matsushita, T., et al.: "Cloning and characterization of the murine antithrombin gene"Thromb Res.. 100. 179-183 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Ishiguro, T.Matsushita, et al.: "Syndecan-4 deficiency leads to high mortality of lipopolysaccharide-injected mice"J Biol Chem.. 276. 47483-47488 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Iwaki, T.Mastushita, et al.: "DNA sequence analysis of protein S deficiency--identification of four point mutations in twelve Japanese subjects"Semin Thromb Hemost. 27. 155-160 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.Kojima, T.Matsushita, et al.: "Plasma levels of syndecan-4 (ryudocan) are elevated in patients with acute myocardial infarction"Thromb Haemost. 85. 793-799 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Kunishima, T.Matsushita, et al.: "Mutations in the NMMHC-A gene cause autosomal dominant macrohrombocytopenia with leukocyte inclusions (May-Hegglin anomaly/Sebastian syndrome)"Blood. 97. 1147-1149 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] S.Kunishima, T.Matsushita, et al.: "Identification of six novel MYH9 mutations and genotype-phenotype relationships in autosomal dominant macrothromhocytopenia with leukocyte inclusions"J. Hum. Genet. 46. 722-729 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Yanada, T.Matsushita, et al.: "Impact of antithrombin deficiency in thrombogenesis : lipopolysaccharide and stress-induced thrombus formation in heterozygous antithrombin-deficient mice"Blood. (in press).
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T. Sugihara. I. Takahashi., T. Matsushita.,etal: "Identification of plasma antibody epitopes and gene abnormalities in Japanese hemophilia A patients with factor VIII inhibitor"Nagoya J Med Sci.. 63. 25-39 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T. Nakayama., T. Matsushita., etal: "A case of purpura fulminans is aused by homozygous delta8857 mutation (protein C-nagoya) and successfully treated with activated protein C concentrate"Br J Haematol. 110. 727-730 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T. Matsushita., D. Meyer., J. E. Sadler.: "Localization of von Willebrand Factor-binding Sites for Platelet Glycoprotein Ib and Botrocetin by Charged-to-Alanine Scanning Mutagenesis"J. Biol. Chem. 275. 11044-11049 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] A. Katsumi., T. Matsushita.,etal: "Severe factor VII deficiency caused by a novel mutation His348 to Gin in the catalytic domain."Thromb Haemosi. 83. 239-243 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K. Ishiguro., T. Matsushita.etal: "Complete antilhrombin deficiency in mice results in embryonic lethality"J Clin Invest. 106. 873-878 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakayama Y., Matsushita,T.,etal: "Cloning and characterization of the murine antithrombin gene"Thromb Res. 100. 179-183 (2000)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K. Ishiguro, T., Matsu.shita.clal: "Syndecan-4 deficiency leads to high mortality of lipopolysaccharide-injected mice."J Bioi Chem. 276. 47483-47488 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T. Iwaki, T., Mastushila,etal: "DNA sequence analysis of' protein S deficiency-identificalion of four point mutations in twelve Japanese subjects."Semin Thromb Hemost. 27. 155-160 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] T. Kojima, T., Matsushita.etal: "Plasma levels of syndecan-4 (ryudocan) are elevated in patients with acute myocardial infarction."Thromb Haemost. 85. 793-799 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S. Kunishima, T., Matsushita,etal: "Mutations in the NMMHC-A gene cause autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions (May-Hegglin anomaly/Sebastian syndrome)"Blood. 97. 1147-1149 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] S. Kunishima, T., Matsushita.etal: "Identification of six novel MYH9 mutations and genotype-phenotype relationships in autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions"J. Hum. Genet. 46. 722-729 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M. Yanada, T., Matsushita.etal: "Impact ofantilhrombin deficiency in thrombogenesis : lipopolysaccharide and stress-induced thrombus formation in heterozygous antithrombin-deficient mice"Blood. in press.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] K. Ishiguro, T. Matsushita, etal: "Syndecan-4 deficiency leads to high mortality of lipopolysaccharide-injected mice"J Biol Chem. 276. 47483-47488 (2001)
• [文献書誌] T. Iwaki, T. Mastushita, etal: "DNA sequence analysis of protein S deficiency--identification of four point mutations in twelve Japanese subjects"Semin Thromb Hemost. 27. 155-160 (2001)
• [文献書誌] T. Kojima, T. Matsushita, etal: "Plasma levels of syndecan-4 (ryudocan) are elevated in patients with acute myocardial infarction"Thromb Haemost. 85. 793-799 (2001)
• [文献書誌] S. Kunishima, T. Matsushita, etal: "Mutations in the NMMHC-A gene cause autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions (May-Hegglin anomaly/Sebastian syndrome)"Blood. 97. 1147-1149 (2001)
• [文献書誌] S. Kunishima, T. Matsushita, etal: "Identification of six novel MYH9 mutations and genotype-phenotype relationships in autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions"J. Hum. Genet. 46. 722-729 (2001)
• [文献書誌] M. Yanada, T. Matsushita, etal: "Impact of antithrombin deficiency in thrombogenesis : lipopolysaccharide and stress-induced thrombus formation in heterozygous antithrombin-deficient mice"Blood. (in press).
• [文献書誌] T.Nakayama.,T.Matsushita.,H. 他: "Short report : A case of purpura fulminans is caused by homozygous delta8857 mutation C-nagoya) and successtully treated with activaled protein C concentrate."Br J Haematol. 110(3). 727-730 (2000)
• [文献書誌] T.Matsushita.,D.Meyer.& J.E.Sadler: "Localization of von Willebrand Factor-binding Sites for Platelet Glycoprotein Ib and Botrocetin by Charged-to-Alanine Scanning Mutagenesis."J.Biol.Chem.. 275(15). 11044-11049 (2000)