| 研究課題/領域番号 |
12671441
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
整形外科学
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| 研究機関 | 東京歯科大学 |
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研究代表者 |
高橋 正憲 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (10095622)
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| 研究分担者 |
兼子 智 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (40214457)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2001年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2000年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | 凍結保存 / 骨膜 / ジメチルスルフォキシド / プログラムフリージング / 植氷 / 骨 |
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| 研究概要 |
IVFAH25培養液に0.2Mトレハロース、12%ジメチルスルフォキシド(DMSO)および50%鶏卵黄を添加したものを用いた。受精9日鶏胚の大腿骨より採取した5mm^2大の骨膜を直接凍結保護剤0.5mlを含む凍結バックに入れ、シールした。プログラムフリーザーを用い、室温/-7.0℃(2.0℃/分)、-7.0℃/-40℃(1.0℃/分)で凍結し、その後液体窒素に浸漬した。融解は微温湯中で行い、培養液で洗浄した。融解骨膜を受精9日鶏卵より作製した漿尿膜培地に移植して10日間培養し、ソフテックスを用いてX線撮影を行い、骨形成の有無を確認した。
骨膜は、凍結保護剤として12%DMSOのみ(D群)は、DMSOに50%鶏卵黄を添加した(D+E群)に比較して骨形成能はやや劣っていた。凍結保護剤への卵黄添加は、融解後の新生骨形成率向上に有用であった。その機序を検討するため、卵黄の精制物として入手可能な精製卵黄油、フォスファチジルコリンを卵黄の代わりに添加しても保護効果を認めたが、全卵黄のほうが保護効果は高かった。卵黄中の何が組織の保護に有用であるかを、電子顕微鏡(TEM)を用いて検討した。D群の骨膜cambium layer表層は細胞間質の構造は配列が乱れ、細胞も不整型でミトコンドリアをはじめとする細胞内小器官の膨化や変性が認められた。D+E群では表層に近い細胞構造はD群と同様の所見であったが、深層の細胞は細胞内小器官に軽度の膨化は認めるものの、細胞膜、細胞接着装置は比較的良く保たれていた。以上より卵黄は組織の凍結保存に際し、組織の表層を保護し深部の組織構築を温存する作用があると考えられる。
同様の実権系で6mm長の骨膜付きの骨の凍結保存を行った。10日間の培養で非凍結群は良好な骨の肥大が認められた。急速凍結群では培養骨は壊死した。D群、D+E群ではコントロール群ほどではないが骨の肥大が認められた。今回は両群間の比較で、骨膜の場台と違いD群の方がやや骨肥大は良好であった。15日鶏胚の大腿骨下端を用いて同様の凍結条件で凍結保存を行い、軟骨組織の凍結保存が可能かどうかを検討した。非凍結のコントロール群では、培養骨端は長軸、横径ともに成長し軟骨染色も良好であった。急速凍結群では壊死となり、成長は認められない。D群、D+E群では中等度の成長を認め、軟骨の染色性も比較的保たれていた。D群の方が良好であった。以上より幼弱骨端部軟骨はDMSOを凍結保護剤として用いブログラムフリーズすることにより、部分的にではあるがviabilityを温存して凍結保存が可能であることが示された。今後、超速凍結法で各組織を凍結保存して、プログラムフリーズ法とのviabilityの比較を行う予定である。
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