| 研究課題/領域番号 |
12671632
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
産婦人科学
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
綾部 琢哉 帝京大学, 医学部, 助教授 (00272568)
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| 研究分担者 |
安藤 義将 帝京大学, 医学部, 助手
高橋 慎一朗 帝京大学, 医学部, 助手
木戸 浩一郎 帝京大学, 医学部, 助手 (40312003)
有木 さおり 帝京大学, 医学部, 助手
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2002年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2001年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2000年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | In situ PCR法 / in situ RT-PCR法 / アポトーシス / 多嚢胞卵巣症候群 |
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| 研究概要 |
もともと本研究は、初期胚の発育過程における糖代謝酵素の変化を遺伝子レベルで解析することを目的として計画された。初期胚は資料が微量であるため、遺伝子レベルでの解析には、数百個の検体をまとめてmRNAを抽出した上で解析する必要があるが、それでは個々の初期胚の個性が失われてしまう。そこで、in situ PCR法を用い、初期胚1個ごとに遺伝子を解析することを考えた。
初年度はin situ PCR法の実際を学ぶために手術で摘出された検体を用いて解析した。次年度は卵子での解析を目指した。しかしながらマウス卵巣組織では切片に卵子を捉えることが困難であった。隣接する切片に卵子を捉えても標本中に必ずしも卵子が捉えられているとは限らず、卵子を単離した状態で包埋し切片を作成する方法も検討してみたが、作成した切片のいずれに卵が含まれているのかがわかり難い。そこで3年目はやむを得ず、目標を卵胞レベルでの解析に切り替えた。具体的には、卵胞壁のアポトーシス遺伝子の変化を、従来から報告されているような卵巣単位ではなく、卵胞単位で解析することを目的とした。マウスの卵巣を凍結包埋し、4〜10μmに薄切してスライドグラス上でin situ PCRを行なった。アポトーシス関連遺伝子としてFasRプライマーを設計し、Perkin-Elmer社製GeneAmp1000を用いて増幅した。遺伝子産物の検出は、PCR反応の増幅時に消費されるdNTPに一定の割合のDIG標識dNTPを添加し、遺伝子産物を直接、抗DIG抗体で検出する方法で行なった。
研究費申請時点で考えていた所期の目的である初期胚の遺伝子発現の解明にまでは至ることができなかったが、方法論の改良が進めば、最終的には初期胚まで辿り着きたいし、もしそれが困難であっても、卵胞レベルでの解析自体、今まで行なわれていない方法であるので、何らかの成績を残せるものと考えている。
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