| 研究課題/領域番号 |
12672031
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
歯周治療系歯学
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
荒川 真一 東京医科歯科大学, 歯学部・附属病院, 助手 (20302888)
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| 研究分担者 |
土田 信夫 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60089951)
中島 琢磨 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (90256678)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2001年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2000年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 細胞死誘導因子(殺細胞因子) / 歯周病原性細菌 / Bacteroides forsythus / G2 arrest / 歯周炎 / アポトーシス / 細胞周期 / CDT(cytolethal distending toxin) / 殺細胞因子 / 細胞死誘導因子 / Actinobacillus actinomycetemcomitans / ネクローシス |
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| 研究概要 |
1.各種細胞に対する殺細胞因子の作用 扁平上皮癌由来細胞、血球系、上皮系の細胞にB.forsythusの超音波破砕物を作用させWST-1アッセイを行ったところ、濃度依存的に細胞死が誘導された。よって、本因子はヒトに共通のレセプターを介するか、或いは、非特異的に細胞を障害すると考えられる。
2.細胞の形態変化 HCT 116細胞を用いSEM, TEMによる観察を行った。SEM所見:細胞膜にrufflingが認められ、典型的なクポトーシス像とは異なっていた。TEM像:核の断片化・凝集、細胞内構造物の膨潤・空胞といった細胞膜の破壊が認められた。
3.殺細胞因子の精製 Bacteroides forsythusの超音波破砕物をDEAE Sepahroseカラム、ゲルろ過により精製を行ったところ、28kDa,40kDa超の2分画に活性が認められた。A_<254>、A_<280>の比較から、本因子は、細菌のDNAと相互作用すると予想され、DNaseIと作用させたところ、28kDaに収斂し活性が認められた。よって、当該毒素は、DNA結合性のタンパク質であることが強く示唆され、さらにヘパリンカラムを用いて精製を行なったところ、強い活性を示す分画を得た。
4.坑殺細胞活性モノクロナール抗体の作製 マウスをB.forsythusの超音波破砕物で免疫した後、リンパ球を分離し、マウスミエローマの細胞株に融合させた。その後、ハイブリドーマから、坑殺細胞活性を保有する抗体を産生するクローンを分離した。
5.細胞周期への影響 MA-1細胞に精製因子を作用させ、P53,Cyclin B1に対する抗体にて染色後、フローサイトメトリーにて分析した結果、殺細胞因子を作用させた細胞は、G2 arrestを起こし、かつ同時期において高レベルのp53,Cyclin B1の発現が認められた。
以上の結果より、本毒素は、CDTの新メンバーであることが示唆される。
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