| 研究概要 |
目的:本研究では、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用した選択的な蛍光検出の方法論2種の確立を目的とした。(1)自然蛍光性の生理活性物質を対象とした分析方法で、蛍光ラベルした後、自然蛍光部→蛍光ラベル部へのFRETを観測する。自然蛍光性でありながら、蛍光ラベル化されない物質や蛍光ラベル化されるが、自然蛍光性でない物質は検出されない。(2)生理活性物質の多くが2個以上の官能基を持つことに着目し,それぞれに個別の蛍光色素をラベル化して,FRETを観測する。同様に、各一個のみの官能基をもつ物質は検出されない。これらの方法では、上記原理による選択性の向上以外にもストークスシフトの延長によるバックグラウンド蛍光の低減も期待できる。
結果・考察:(1)の自然蛍光性の生理活性物質としてインドールアミン類およびカテコールアミン類を選択し、市販15種類の蛍光誘導体化試薬についてスクリーニングを行った結果、o-フタルアルデヒド(OPA)が最も実用的であることがわかった。本法を尿試料のプレカラム蛍光HPLCに適用した結果、FRET検出の高感度性と高選択性を実証することが出来た。(2)の二つの官能基を持つ生理活性物質としては、アミノ基とチオール基を持つホモシステインおよびシステインをモデルに、市販の多くの試薬について検討したが、比較的近い位置に二つの異なる色素をラベルすることが困難であった。現在、引き続効率的な二重ラベル化方法を検討している。
まとめ:自然蛍光性のインドールアミン類およびカテコールアミン類をOPA誘導体化し、自然蛍光部→OPA蛍光部へのFRETを観測することにより、高選択的かつ高感度な分析が可能となった。本方法論は、他の自然蛍光性物質にも適用可能と考えられる。更に応用範囲を拡大するには、多重ラベル化法を開発する必要があり、今後の課題である。
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