| 研究課題/領域番号 |
12672120
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
瀬高 守夫 帝京大学, 薬学部, 教授 (70012630)
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| 研究分担者 |
佐藤 典子 帝京大学, 薬学部, 助手 (80162460)
唐沢 健 帝京大学, 薬学部, 助教授 (50186029)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2002年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2001年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2000年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 血小板活性化因子 / platelet activating factor / PAF / PAF合成酵素 / 膜結合型酵素 / 酵素精製 / PAF合成酵 / 膜結合酵素の精製 |
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| 研究概要 |
PAF生合成にかかわる本酵素(AAG-CPT)はPAFのde novo合成の最終段階で1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycerol(AAG)とCDPコリンからPAFを合成する膜結合酵素である。私共はこの酵素の精製を目指した。
1.ブタ脾臓ミクロソームからdigitoninを使って、AAG-CPTを可溶化した。この酵素活性は室温で非常に安定であり、440kDaという大きな分子量をもつことが示された。
2.DEAE-Sepharoseカラムにかけ、部分精製したAAG-CPTは、精製が明らかに進んでいるにもかかわらず、比活性は上昇していなかった。活性低下したこの酵素にegg PC、dioleoyl PC、PE、DG、PSを添加するとその活性は著しく上昇し、安定化したが、dioleoyl PAの添加では反対にAAG-CPTの活性は減少し、阻害された。
3.可溶化AAG-CPTをカラムに吸着させ、溶出すると、その活性は極端に低下した。その理由は、可溶化酵素が固体表面の影響を受けて、その立体構造がゆがみ、活性低下を引き起こすと推定される。そこで、分子構造が柔軟で、自由に変化できるDEAE-デキストラン高分子を用いてSoft Surfaceカラムクロマト法を考案した。
4.私共はまた、Nativeジギトニンカラム電気泳動法を開発した。本酵素は分子量が大きく、通常のSDS-ポリアクリルアミドゲルの孔の中を泳動できない。そこで、タイゴンチューブの中にSephacryl-1000を詰めゲルの代用とし、界面活性剤としてdigitoninを用いた。
5.部分精製蛋白の中から本酵素を特定する為、AAG-CPTに特異的な光ラベルによる放射標識化の方法を開発した。AAGにアジド化合物を共有結合で結合させたラベル剤を合成した。予備実験によると、標識された蛋白が存在し、現在はその収量を高める条件を探索している。
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