| 研究課題/領域番号 |
12672247
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態検査学
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| 研究機関 | 宮崎医科大学 |
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研究代表者 |
橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2001年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2000年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
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| キーワード | 酵素免疫測定法 / 核酸 / HIV-1 / 早期診断 / RT-PCR / RNA / DNA / β-D-ガラクトシダーゼ |
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| 研究概要 |
従来のHIVやHCV等のプロウイルスDNAやウイルスRNAの測定法は、理論値とは程遠い検出感度(数百〜数万コピー)である。これは、蛍光、発光物質や酵素標識した標識物の非特異結合によるシグナルが、測定系の高感度を妨げているためである。そこで、申請者らが開発した2点結合(特異結合物質・測定物質)複合体転移法という画期的な方法を用い、特異シグナルは維持し、非特異シグナルをほぼ完全に除去することにより、超高感度測定を可能とすることを目的とした。12年度は、HIV-1 p24抗原の超高感度測定法とRT-PCR法の検出感度を、Seroconversion panel serumを用い、比較検討した。その結果、p24抗原とRNAの検出時期は殆ど同時期であった。この時のRT-PCR法の検出限界は、400コピー/mlであった。しかし、抗p17IgGやIgMがp24抗原やウイルスRNAの検出時期より早期に検出されたため、この抗p17IgGやIgMの検出時期以前にウイルスRNAの存在が示唆された。しかし、現法のRT-PCR法では、このような早期には、ウイルスRNAを検出することができなかった。そこで、RT-PCR後のDNAプローブとのハイブリダイゼイション以降の高感度化を検討した。β-D-ガラクトシダーゼを標識したDNAプローブを用い、2点結合法による検出を試みたが、非特異結合が異常に大きく、検出感度はpmolレベルであった。13年度は、非特異結合を完全に除去するために、上記方法に転移法を加え、非特異結合を低下させた。FITC・DNP標識アビジン-ビオチン化DNA・プローブIとβ-D-ガラクトシダーゼ標識アビジン-ビオチン化DNA・プローブIIを用い、測定すべき増幅DNAとハイブリダイゼイション、続いて、抗DNP IgG不溶化固相上にトラップする。洗浄後、過剰のDNP-リジン添加により、複合体を固相より溶出し、抗FITC IgG不溶化固相上に転移させる。最後に、固相上の酵素活性を測定する。この転移法を角いたところ、10amol(10^<-17>mol)の検出が可能となった。PCRにより10^<6〜8>コピーの増幅が可能であるため、最低でも、10^<-23>mol(6分子)の検出の見通しがえられた。
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