| 研究課題/領域番号 |
12680610
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 愛知教育大学 |
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研究代表者 |
羽渕 脩躬 愛知教育大学, 教育学部, 教授 (90024067)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2001年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2000年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | コンドロイチン4硫酸転移酵素 / GalNac4硫酸6硫酸転移酵素 / コンドロイチン硫酸E / イカ軟骨 / GalNac4硫酸転移酵素 / コンドロイチン6硫酸転移酵素 / GalNAc4硫酸6硫酸転移酵素 / GalNAc4硫酸転移酵素 / シピレエイ |
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| 研究概要 |
1.マウス及びヒトコンドロイチン4硫酸転移酵素(C4ST)をクローニングし、発現酵素の活性測定、組織での発現パターン、染色体マッピングを行った。
2.C4STの相同遺伝子として、脳下垂体で発現している、ヒトGalNAc4硫酸転移酵素(GaLNAc4ST)をクローニングし、その特異性を決定した。GalNAC4STI及びIIのマウスcDNAをクローニングした。マウスGalNAc4ST-Iの発現パターンは脳で強く発現しておりヒトGaINAc4ST-Iの発現パターンと似ていたがマウスGalNAc4ST-IIの発現パターンはヒトGalNAc4ST-IIとは異なっていた。
3.シビレエイ神経組織からクローニングされたNSISTを動物細胞で発現し、コンドロイチン6硫酸転移酵素と似た酵素活性を検出した。
4.GalNAc4硫酸6-O-硫酸転移酵素(GalNAc4S-6ST)遺伝子のクローニングと特異性の決定
イカ軟骨から精製したGalNAc4S-6STのアミノ酸配列に基づき、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。イカ軟骨から抽出し精製したpoly(A)^+RNAを鋳型としてcDNAを合成し、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行い、GalNAc4S-6STのcDNA断片を増幅した。このDNA断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列をもとにFASTA検索を行った結果、アミノ酸配列で40%の相同性を示すヒトのcDNAクローンを検出した。動物細胞で発現した蛋白質は、GalNAc4硫酸残基の6位に硫酸基を転移する活性を示した。コンドロイチン硫酸A、デルマタン硫酸を基質に用いると、非還元末端と内部のGalNAc4硫酸残基の6位が硫酸化されたが、4硫酸化オリゴ糖を基質に用いたときは、非還元末端のGalNAc4硫酸残基の6位のみが硫酸化された。ヒトGalNAc4S-6STはリンパ球、脾臓などの免疫組織で強く発現していた。またすでに報告されていたヒトRAG-1関連遺伝子(hBRAG)と塩基配列では99%一致しており、免疫系での機能が推定される。
5.コンドロイチン4硫酸転移酵素(C4ST)遺伝子の解析とターゲッティングベクターの作成
マウスのゲノムライブラリーから、C4STのアミノ末端を含むゲノムクローンを取り出し、制限酵素地図を作成した。
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