研究課題/領域番号 |
12680676
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研究種目 |
基盤研究(C)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
研究分野 |
分子生物学
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研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
研究代表者 |
秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80273837)
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研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2001年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2000年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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キーワード | バイパスDNA合成 / 損傷乗り越えDNA複製 / アフリカツメガエル / DNAポリメラーゼ・ゼータ / REV3遺伝子 / DNA損傷 / 突然変異 / 複製フォーク / DNAポリメラーゼ / アフリカツメガエル卵母細胞 / スライディングクランプ |
研究概要 |
DNA損傷による複製フォークの進行阻害を回避する経路の一つにバイパスDNA合成機構(損傷乗り越えDNA複製)があり、真核生物では従来の複製型DNAポリメラーゼとは性質の異なるDNAポリメラーゼ・ゼータ(DNA polymerase ζ)が関与している。これまでに明らかにされていない脊椎動物のバイパスDNA合成機構の解明を目的として、本研究ではアフリカツメガエルのDNAポリメラーゼ・ゼータの同定と精製、およびDNAポリメラーゼ・ゼータの作用機構の検討を計画した。 成果1.アフリカツメガエルの卵からREV3遺伝子をコードするcDNAを単離した。 成果2.コドンバイアスを補正することによってREV3遺伝子の一部を大腸菌で発現させる系の構築に成功し、この系を使って2種類のREV3遺伝子断片を大腸菌で発現させた。発現したREV3部分蛋白質を精製し、それぞれに対する特異的な抗体を作製した。これらのエピトープの異なる抗体を用いた免疫沈降とウエスタンブロツトにより、REV3蛋白質の予想される大きさに一致する分子量約350kDaの蛋白質をアフリカツメガエルの卵母細胞抽出液中に同定できた。 成果3.試験管内でバイパスDNA合成を検出する系の構築に成功し、アフリカツメガエルの卵母細胞抽出液中には少なくとも3種類のバイパスDNA合成活性が存在することを明らかにした。 上記の研究成果から、内在性REV3蛋白質を同定でき、免疫学的方法と酵素学的方法の2本立てでDNAポリメラーゼ・ゼータを精製する体制が整った。今後の研究では、免疫沈降法で同定したREV3蛋白質を追跡し、3つのバイパスDNA合成活性との関係を検討しながらDNAポリメラーゼ・ゼータの精製を進める。精製した酵素を使って、DNA損傷により停止した複製フォークに対するDNAポリメラーゼ・ゼータの作用機構を解明する。
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