| 研究概要 |
1.xyn3のプロモーターの比較
T.reesei PC-3-7株からクローニングしたxyn3を含む3.2kb EcoRI断片の塩基配列を決定した。さらに、ソルボースによりキシラナーゼIII(XYNIII)を誘導したT.reesei PC-3-7株から精製したRNAを鋳型に用いたRT-PCRによってxyn3cDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。xyn3ORFは1,044bpであり、347アミノ酸からなる推定分子量38,076Daのタンパク質をコードしていた。XYNIII推定アミノ酸配列から本酵素が糖質加水分解酵素のFamily10に分類される事を明らかにした。また、xyn3染色体遺伝子とcDNAの比較からxyn3遺伝子には、3つのイントロンが存在する事を示した。
塩基配列を決定したxyn3遺伝子のプロモーター領域(1.0kb)には、真核生物に一般的なプロモーター配列であるTATA boxやCAAT boxはもとより、カーボンカタボライト抑制のcis-elementや興味深いことにAspergillus nigerにおいてキシラナーゼの発現を正に調節するXlnRのcis-elementも存在した。現在、xyn3遺伝子の発現が観察されないT.reesei QM9414株からクローニングした遺伝子について塩基配列の解析を進めている。
2.レポーター遺伝子の発現によるプロモーター解析
レポーター遺伝子による解析に先立ち、T.reeseiへ遺伝子導入を行うために必要なプロトプラストの調製法について検討した。当初、プロトプラスト再生率は0.01%以下であった。細胞壁溶解酵素の種類、濃度、作用時間、再生培地の組成について最適化を試みることで、プロトプラスト再生率を形質転換実験に用いることが可能な5〜10%にする事に成功した。
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