| 研究課題/領域番号 |
12760065
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
北村 昌也 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20244634)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2001年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2000年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | FMN / X線結晶構造解析 / 2量体 / 硫酸還元菌 / タンパク質工学 / 変異体 / 酸化還元電位 / 解離定数 / 動的光散乱 |
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| 研究概要 |
硫酸還元菌由来のFMN結合タンパク質について、タンパク質工学的な研究を行った。カルボキシル末端に存在する122番のロイシン残基を欠失させた変異型FMN結合タンパク質およびチロシン、リジン、グルタミン酸残基に置換した変異型FMN結合タンパク質を遺伝子工学的に創出し、その性質を調べた。超遠心場における拡散平衡測定により、122番のロイシン残基を欠失、ないしチロシン残基に置換することによって、2量体形成において、モノマー同士の結合が強まっていることが、明らかになった。また、FMNとの結合においては、チロシン改変体を除いてすべて弱まっていたが、特に欠失変異体では非常に弱まっていた。一方、リジン改変体の酸化還元電位は、若干正にシフトする一方で、グルタミン酸改変体では、大きく負に変化した。これらの結果から、122番のロイシン残基は、FMNを結合するために必要な空間を確保すると同時に2量体間に適当な距離を作る以外に、酸化還元電位にも大きな影響を与えていると考えた。一方、野生型FMN結合タンパク質のX線結晶構造解析の結果から、ユニットセル当たり2分子存在する2量体構造となっており、ペプチド鎖同士が相互作用をしている事、および、2量体を形成する事によってペプチド鎖とFMNの結合を強めている事がわかった。さらに、122番のロイシン残基は、FMNのイソアロキサジン環近傍に存在し、2量体形成に重要であることが示唆できた。さらに、変異体についても、結晶化を行い、それらのX線結晶構造解析を行ったところ、チロシン改変体では、結晶中において、イソアロキサジン環とスタッキングしている分子と、離れて存在する分子が混在することがわかった。この事が、FMNとの結合や酸化還元電位にどのような影響を与えているかについて、考察した。
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