| 研究課題/領域番号 |
12760067
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
時下 進一 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (60266898)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
2001年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2000年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | HIF-1β / HIF-1α / 低酸素応答 / オオミジンコ / ヘモグロビン鎖遺伝子 / クラスター構造 |
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| 研究概要 |
1 オオミジンコにおけるHIF-1β機能解析と発現組織の特定 オオミジンコHIF-1βの機能のを調べるために、オオミジンコHIF-1β(Dap HIF-1β)がHIF-1βを欠損した培養細胞の低酸素応答を相補できるか否かを調べた。Dap HIF-1β発現プラスミドをマウス培養細胞Hepa c4に導入し、prolyl 4-hydroxylase(PH) α(I)の低酸素応答エレメントをエンハンサーとしてもつルシフェラーゼレポーター遺伝子の低酸素に応答した発現を調べた。その結果、低酸素に応答したルシフェラーゼ活性の増加が認められた。そのレポーター活性の増加は遺伝子上流の低酸素応答エレメントの配列(HRE)に依存しているか否かを調べるためにHRE内に変異を導入したルシフェラーゼレポーター遺伝子の低酸素に応答した発現を調べた。その結果、レポーター活性の上昇は認められず、低酸素応答エレメントの配列(HRE)に依存していることが示された。ミジンコHIF-1βに対する特異抗体を用いて、成体と胚の抗体染色を行った。成体については低酸素状態で飼育したものと通常酸素状態で飼育したものとを調べた。その結果、ミジンコ胚では、大額、小額、甲皮、殻腺、5つの胸脚、第2触角、正中線などの核に特異的な染色が認められた。この染色された組織のいくつかは、ショウジョウバエのHIF-1β homologであるTgoと同様に、HIF-1βとヘテロ二量体をつくるbasic helix-loop helix(bHLH)因子が発現していると考えられる組織の核に特異的に存在していると考えられた。また、成体についても免疫染色を行い、鰓脚の一部であるエピポッドと呼ばれるヘモグロビンを生産している組織の核に局在することを明らかにした。しかし、このエピポッドの核染色は十分な酸素条件下および低酸素条件下で飼育したミジンコにおいて観察された。
2 ミジンコにおけるHIF-1α homologの単離 HIF-1のサブユニットであるHIF-1αについて、two-hybrid法を用いて、HIF-1αをコードするcDNAの単離を行なうため、ミジンコより調製したRNAを用いてtwo-hybrid用のライブラリーの作製をい、GAL4 binding domainnとHIF-1βのbHLHの融合遺伝子により、スクリーニングを行った。その結果、他の生物のHIF-1αと高い相同性を示すクローンを単離することに成功した。
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