| 研究課題/領域番号 |
12771424
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| 研究種目 |
奨励研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
服部 明 理化学研究所, 細胞生化学研究室, 研究員 (50300893)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
2001年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2000年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | アミノペプチダーゼ / オキシトシナーゼ / 胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ / 脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ / オキシトシナーゼサブファミリー / 遺伝子構造 / プロモーター領域 / X線結晶構造解析 / ペプチドホルモン / 金属酵素 / CHO細胞 / 血圧調節 |
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| 研究概要 |
前年度の解析において、ヒト脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ(A-LAP)遺伝子の構造を明らかにしたため、本年度は遺伝子のプロモーター領域の解析を行った。その結果、ヒトA-LAP遺伝子は少なくとも2カ所から転写が開始されることが明らかとなった。また、転写開始点上流にはTATAあるいはCAATT boxが存在しなかったが、典型的なイニシエーター配列と種々の転写因子結合部位が存在していた。レポーターアッセイによってプロモーター活性を有する領域を決定した結果、転写開始点上流の-248から-176bpまでの領域が重要であることが明らかになった。また、A-LAPはインターフェロンによって発現亢進を受けることも見いだし、さらに上述のヒトA-LAP遺伝子の5' flanking regionにはインターフェロンによって調節を受けうる領域が存在していたことから、この領域の役割を検討した。しかしながら、本領域のインターフェロンによる調節は認められなかったため、今後は下流域についても同様の解析を進める予定である。
A-LAPの立体構造を解明するためX線結晶構造解析を進めた。当初、CHO細胞を用いて大量発現させたA-LAPタンパク質を材料に用いたが、結晶化するものの解析に十分な回折データを得ることができなかった。その原因として、タンパク分子に結合している糖の影響が考えられたため、含有糖鎖量を減らしたタンパク質の発現を試みた。まず、野生型A-LAPに結合している糖鎖について解析したところ、野生型には4本のアスパラギン結合型糖鎖が結合していることがわかった。さらに詳細に解析した結果、最もアミノ末端に存在する糖鎖は、タンパク質の分泌、安定性に大きく関与していることが明らかになった。そこでX線結晶構造解析に向けて、アミノ末端のみに糖を残した遣伝子組み換え型A-LAPの大量調製系を確立・精製後、結晶化および構造解析へと順次進める予定である。
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