発現蛋白質を合成ブロックとして用いる高純度長鎖ペプチド合成法の開発

• 研究課題/領域番号: 12780440
• 研究種目: 奨励研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物有機科学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 川上 徹 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (70273711)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2001
• 研究課題ステータス: 完了 (2001年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2001年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2000年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
• キーワード: ペプチド合成 / リン酸化ペプチド / ペプチドチオエステル / Max蛋白質 / 安定同位体標識 / ペプチド結合形成

研究概要

化学的方法と生物学的方法を融合する新規な高純度長鎖ペプチドの合成法の開発を目的として研究を行った.本研究では,NMRを用いた構造解析を念頭におき,部分的に安定同位体標識した蛋白質の合成を行った.
1.部分保護C-端ペプチド合成ブロックの合成法の開発
申請者らが開発した長鎖ペプチド合成法,チオエステル法,を適用するために,発現蛋白質をカルボキシ(C)端相当する合成ブロックへ誘導する方法を開発した.これにより,遺伝子組換法により大腸菌を用いて調製したMax蛋白質の部分ペプチド,Max(22-110)から,部分保護ペプチドセグメント,[Lys(Boc)^<24,34,40,57,66,77,89,104>]-Max(23-110)(1)を合成した.
2.Max蛋白質,リン酸化部分ペプチド(1-110)の合成
リン酸化ペプチドチオエステルセグメント,Boc-[Ser(PO_3H_2)^<2,11>]-Max(1-22)-SCH_2CH_2CO-Leu-OH(2)はBoC法により合成した.これらの合成ブロック1と2を銀塩存在下で縮合し,保護基を除去し,[Ser(PO_3H_2)^<2,11>]-Max(1-110)を合成した.さらに,安定同位体で均一に標識した合成ブロック1を調製し,非標識リン酸化ペプチドチオエステル2との縮合により,部分的に標識したリン酸ペプチドを合成した.
3.保護基を用いない新規な縮合法による長鎖ペプチドの合成法の開発
チオエステル法においては縮合時に保護基を必要とし,有機溶媒中で反応を行う.この問題を回避するために,より温和な条件で縮合反応を行う方法を開発した.C端側合成ブロックのN端に縮合補助基を用い,それを発現蛋白質に応用するために,遊離のペプチドからその合成ブロックを調製する方法を開発した.

研究成果

• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Polypeptide Synthesis Using an Expressed Peptide as a Building Block via the Thioester Method"Tetrahedron Letters. 41,15. 2625-2628 (2000)
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Synthesis of a Phosphorylated Polypeptide Using an Expressed Peptide as a Building Block"Peptide Science 2000. 21-22 (2001)
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Peptide Bond Formation Mediated by 4, 5-Dimethoxy-2-mercaptobenzylamine after Periodate Oxidation of the N-terminal Serine Residue"Organic Letters. 3,9. 1403-1405 (2001)
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Synthesis of phosphorylated polypeptide by the thioester method using a recombinant protein"Peptides : The Wave of the Future. (印刷中).
• [文献書誌] Saburo Aimoto et al.: "The Use of a Free Peptide for Preparation of a C-Terminal Building Block for Polypeptide Synthesis in Combination with a Peptide Thioester"Peptides : The Wave of the Future. (印刷中).
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Polypeptide Synthesis Using an Expressed Peptide as a Building Block for Condensation with a Peptide Thioester : Application to the Synthesis of Phosphorylated p21Max Protein(1-101)"Journal of Peptide Science. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Polypeptide Synthesis Using an Expressed Peptide as a Building Block via the Thioester Method"Tetrahedron Letters. 41,15. 2625-2628 (2000)
• [文献書誌] Toru Kawakami et al.: "Synthesis of a Phosphorylated Polypeptide Using an Expressed Peptide as a Building Block"Peptide Science 2000. (印刷中). (2001)