| 研究課題/領域番号 |
12877002
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| 研究種目 |
萌芽的研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
解剖学一般(含組織学・発生学)
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| 研究機関 | 山梨医科大学 |
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研究代表者 |
大野 伸一 山梨医科大学, 医学部, 教授 (50109170)
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| 研究分担者 |
藤井 靖久 山梨医科大学, 医学部, 助手 (60126703)
馬場 健 山梨医科大学, 医学部, 助教授 (90208710)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
2001年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2000年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 赤芽球分化過程 / ダイナミン / エンドサイトーシス / トランスフェリンリセプター / ディープエッチング法 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、赤血球の脱核分化過程におけるエンドサイトーシスの関与を、変異ダイナミン遺伝子導入赤芽球系細胞を用いて検討することであった。平成12年度は、ヒト赤芽球系細胞培養法の確立と分化誘導条件について検討した。ヒト腰帯血から得られた細胞を、未成熟造血前駆細胞および幹細胞で特異的に発現するマーカーAC133に対する特異抗体で精製した。AC133陽性細胞を赤芽球系への分化誘導後、光顕用ギムザ染色、トランスフェリンリセプターの免疫組織化学的染色、およびエポン包埋材料の電顕的観察により検討した。その結果、分化誘導3日目より典型的な正染性赤芽球が出現し、以後その割合は増加していった。脱核幼若赤血球は分化誘導5日目より認められるようになった。トランスフェリンリセプター陽性細胞も3日目より出現し、次第に増加した。次に、分化誘導3日目の細胞を用いて、変異ダイナミン遺伝子の導入を試みた。アデノウイルスベクター法では効率が悪いことが判明したため、代わりにトランスフェリンフェクション法を用いた。平成12年度の本研究により、赤芽球系細胞に変異遺伝子の導入が可能となったので、平成13年度は野生型、および変異ダイナミン遺伝子導入した赤芽球細胞を経時的に培養し、以下の検討を行った。(1)4%パラホルムアルデヒドで固定し、サポニン処理後、抗ダイナミン抗体、抗HAtag抗体、抗クラスリン抗体を用い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。(2)細胞膜剥離観察法により、各細胞の上部細胞膜を剥離回収し、レプリカ膜を作製した。一部の試料は抗ダイナミン抗体とコロイド金標識二次抗体を用いた免疫金染色を加えた。(3)赤芽球細胞を急速凍結し、凍結割断を行い、レプリカ膜を作製した。以上の結果より赤芽球分化過程に伴う両側陥凹円盤状赤血球形態形成とトランスフェリン取込みエンドサイトーシスが関連性を有することが明かとなった。
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