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レゾルフィン類/フラビン酵素系を用いる新規生体分析法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 12877353
研究種目

萌芽的研究

配分区分補助金
研究分野 物理系薬学
研究機関大阪大学

研究代表者

大森 秀信  大阪大学, 薬学研究科, 教授 (90028845)

研究分担者 前田 初男  大阪大学, 薬学研究科, 助教授 (00229311)
研究期間 (年度) 2000 – 2001
研究課題ステータス 完了 (2001年度)
配分額 *注記
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2001年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2000年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
キーワードグルコース / 過酸化水素 / 酸素分析 / 指示反応 / 蛍光分析 / 血糖値測定 / パーハイドロリシス / レゾルフィン / グルコースオキシダーゼ / 酵素分析
研究概要

前年度の知見に基づき、レゾルフィン(1)を生成する還元およびパーハイドロリシス反応について、グルコースおよび過酸化水素(H2_O_2)分析における指示反応としての可能性を検討し、以下の知見を得た。
1)アセチルレゾルフィン(3)がH_2O_2との反応(パーハイドロリシス)により1に変換されること、ならびに、本パーハイドロリシスを蛍光指爪反応として用いることによりグルコースオキシダーゼのみを用いてグルコース分析できることを明らかにした。また、本指示反応は、除タンパク操作は必要とはするものの、アスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を受けることなく血糖値測定に利用できることも見い出した。
2)レサズリン(2)から1への還元を指示反応とするグルコースの酵素分析系すなわちグルコースデヒドロゲナーゼ/NAD+/ジアホラーゼ/2系について最適化を行い、本手法が除タンパク処理を必要としない、且つ、アスコルビン酸の影響を受けない血糖値測定法となることを明らかにした。
3)3のパーハイドロリシスはグルコース分析における有効な蛍光指示反応として利用できるが、多様な試料中のH_2O_2分析に適用するには、ブランク溶液における単純加水分解による蛍光応答を極力小さくする必要がある。そこで、様々なアシルレゾルフィンを合成するとともに、様々な条件下におけるそれらのパーハイドロリシスに対する感受性ならびに単純加水分解に対する抵抗性を評価した。その結果、アシルレゾルフィン、緩衝液ならびに反応温度として、それぞれピバロイルレゾルフィン、リン酸緩衝液(pH8.0、20mM)ならびに25℃を用いた場合、H_2O_2をより高感度に且つ広い定量濃度範囲で蛍光分析できることを明らかにした。また、リン酸緩衝液(pH7.5、20mM)を用いる、すなわち、より中性に近い条件下における高感度H_2O_2分析はイソブチリルレゾルフィンを用いることにより行えることも見い出した。
4)レゾルフィンとは異なる蛍光特性を示すフルオレセイン類や7一ハイドロキシクマリン類のアシル化体が、アシルレゾルフィン類と同様にパーハイドロリシスを受けること、ならびにH_2O_2分析のおける蛍光色原体として利用できることを明らかにした。その結果、分析サンプルに応じて異なる励起および検出波長が利用可能なH_2O_2分析法を確立することができた。

報告書

(2件)
  • 2001 実績報告書
  • 2000 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (8件)

  • [文献書誌] 前田初男: "Hydrogen peroxide-induced deacetylation of acetyl resorufin as a novel indicator reaction for fluorometric detection of glucose using only glucose oxidase"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49. 294-298 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 前田初男: "Resazurin as an electron acceptor in glucose oxidase-catalyzed oxidation of glucose"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49. 622-625 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 松浦伸哉: "Blood glucose determination with an acetyl resorufin-glucose oxidase system as a fluorometric indicator reaction"Bunseki Kagaku. 50. 475-479 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 前田初男: "Assessment of acyl groups and reaction conditions in the competition between perhydrolysis and hydrolysis of acyl resorufins for developing an indicator reaction for fluorometric analysis of hydrogen peroxide"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 50. 169-174 (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 松浦伸哉: "Blood glucose determination with the reduction of resazurin as a fluorometric indicator reaction"Bunseki Kagaku. 51. 111-115 (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 前田初男: "Resorufin as an Electron Acceptor in Glucose Oxidase-Catalyzed Oxidation of Glucose"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 48. 897-902 (2000)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] 前田初男: "Hydrogen Peroxide-Induced Deacetylation of Acetyl Resorufin as a Novel Indicator Reaction for fluorometric Detection of Glucose Using only Glucose Oxidase"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49(in press). (2001)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書
  • [文献書誌] 前田初男: "Resazurin as an Electron Acceptor in Glucose Oxidase-Catalyzed Oxidation of Glucose"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49(in press). (2001)

    • 関連する報告書
      2000 実績報告書

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公開日: 2000-04-01   更新日: 2016-04-21  

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