個体生命を支える素機構の統合

• 研究課題/領域番号: 12CE2007
• 研究種目: 特別推進研究(COE)
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 近藤 寿人 (近藤 壽人) 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (70127083)
• 研究分担者: 濱田 博司 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (00208589) ; 田中 亀代次 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (80144450) ; 杉野 明雄 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (90231737) ; 辻本 賀英 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (70132735) ; 米田 悦啓 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (80191667)
• 研究期間 (年度): 2000 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 1,990,000千円 (直接経費: 1,690,000千円、間接経費: 300,000千円); 2004年度: 390,000千円 (直接経費: 300,000千円、間接経費: 90,000千円); 2003年度: 442,000千円 (直接経費: 340,000千円、間接経費: 102,000千円); 2002年度: 468,000千円 (直接経費: 360,000千円、間接経費: 108,000千円); 2001年度: 340,000千円 (直接経費: 340,000千円); 2000年度: 350,000千円 (直接経費: 350,000千円)
• キーワード: ゲノム情報 / 転写調節 / シグナル分子 / DNA複製 / DNA修復 / 細胞内物質輸送 / アポトーシス / ノックアウトマウス / 転写調節因子 / レチノイン酸 / DNA損傷 / インポーティン / 細胞分化 / SOX / POU / コケイン症候群 / DNA polymerase / ターゲティング / importin / XAB

研究概要

本研究は、(1)それぞれの細胞が持つ核に与えられている一組の遺伝情報(ゲノム情報)がどのようにして読み出され、個体をつくるのか?(2)その個体では、ゲノムや細胞がうけるさまざまな損傷をどのように修復して健全な生命を維持するのか?という生命の基本問題に答えようとするものである。異体的な素機構(遺伝子複製・修復・転写、分化調節、アポトーシス、核 細胞質間輸送などに関するもの)の解析から出発しつつ、階層縦断的なアプローチからなる組織的な研究を実施して、個体の形成と個体生命の維持機構の全体像を示すことを目標とした。
平成16年度には、以下に述べる研究の進展がみられた。
1.分泌タンパク質Nodalとその阻害タンパク質の相互作用によって細胞内のSmad-FoxH1タンパク質複合体の活性が制御されて原始内胚葉領域が移動し、それが、胚の将来の脳(前側)部分を裏打ちして体の頭尾方向が決まることを示した。多系統のノックアウトマウスと高度の胚操作技術を駆使した。(濱田)
2.その過程の後、神経誘導のプロセスによって、SOX2転写調節因子遺伝子が発現を開始して、胚の中の将来の脳を規定しながら頭部側より尾部側に向かって発現領域を広げる。神経誘導の開始、また、異なった脳部域を制御する5種類のエンハンサーを見つけて、神経誘導および脳の部域化の各ステップを分析した。SOX2は単独で作用するのではなく、PAX, POUファミリーの転写複合体をつくり、それらの複合体がもつDNA結合と活性の特異性にもとづいて遺伝子群を制御することを示した。(近藤)
3.転写と共役したDNA修復に関与するXAB2蛋白質複合体を中心とした研究をすすめた。色素性乾皮症A群(XPA)蛋白質に結合する蛋白質であるXAB2を含む蛋白質複合体の精製を行い、分析した。XAB2蛋白質コア複合体は6種類の構成因子からなることがわかった。複合体構成因子の幾つかはスプライシング因子として知られているものであった。XAB2をノックダウンした細胞は、TCR能が低下し、紫外線高感受性となり、mRNAスプライシングにも異常を示した。XAB2が、TCR、転写、スプライシングに関与する多機能性蛋白質複合体の繋ぎめ的因子であることが示された。(田中)
4.DNA複製開始に必須な新しい蛋白複合体GINS(Sld5-Psf1-Psf2-Psf3の複合体)を分析した。この蛋白複合体は染色体複製に必須なDNA polymerase εと直接相互作用して、染色体複製開始反応を行っていることをin vivo及びin vitroで明らかにした。一方、この染色体複製開始を厳密に制御しているCdc7/Dbf4 protein kinase複合体の複製開始反応における機能解析を行い、Cdc7/Dbf4複合体がMcm2-7複合体に定量的に結合することが重要であることを明らかにした(杉野)
5.アポトーシス反応の惹起にかかわるミトコンドリア膜透過性の制御をノックアウトマウスを用いて解析した。ミトコンドリア膜透過性亢進に関わることが示唆されていたシクロフィリンDノックアウトマウスを作製した。このマウスのミトコンドリアは、Caなどにより誘導される膜透過性亢進現象を起こさないことを示した。また、ミトコンドリア膜透過性に関与する可能性を見いだした新規のミトコンドリア膜チャネルの機能の詳細な解析を実施した。(辻本)
6.転写調節因子の核局在化シグナル受容体であり、importin βと核蛋白質の結合を仲介するアダプダー分子であると考えられていたimportin αが、importin βと関係なく、それ自身の能力で核膜孔を通過できることを示し、輸送機構の多様性を明らかにしてきた。また、importin βの変異体を利用することにより、核膜孔の核内外通過において重要なimportin βの核膜孔複合体相互作用領域を決定することができ、核膜孔通過の方向性決定の理解に向けた研究を進めることができた。(米田)

研究成果

• [雑誌論文] Interplay of SOX and POU factors in regulation of the Nestin gene in neural primordial cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, S., Hamada, H., Kondoh, H.et al.
  • 雑誌名: Mol Cell Biol 21 ページ: 8834-8846
• [雑誌論文] Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, M., Meno, C., Hamada, H.et al.
  • 雑誌名: Nature 428 ページ: 387-392
• [雑誌論文] Complete absence of Cockayne syndrome group B gene product gives rise to UV-sensitive syndrome but not Cockayne syndrome. (2004)
  • 著者名/発表者名: Horibata, K., Tanaka, K.et al.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 101 ページ: 15410-15415
• [雑誌論文] Distinct roles of DNA polymerases, delta and epsilon at the replication fork in Xenopus egg extracts. (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukui, T., Waga, S., Sugino, A., et al.
  • 雑誌名: Genes Cells 9 ページ: 179-191
• [雑誌論文] Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes. (2004)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, S., Tsujimoto, Y.et al.
  • 雑誌名: Nature Cell Biol. 279 ページ: 52726-52734
• [雑誌論文] Cellular stresses induce the nuclear accumulation of importin alpha and cause a conventional nuclear import block. (2004)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto, Y., Yoneda, Y., et al.
  • 雑誌名: J Cell Biol 165 ページ: 617-623
• [文献書誌] Uchikawa, M., Kondoh, H.et al.: "Functional analysis of chicken Sox2 enhancers highlights an array of diverse regulatory elements that are conserved in mammals."Dev.Cell. 4. 509-519 (2003)
• [文献書誌] Yamamoto, M., Hamada, H.et al.: "Nodal signaling induces the midline barrier by activating Nodal expression in the lateral plate."Development. 130. 1795-1804 (2003)
• [文献書誌] Groisman, J., Tanaka, K., Nakatani, Y.et al.: "The ubiquitin ligase activity in the DDB2 and CSA complexes is differentially regulated by the COP9 signalosome in response to DMA damage."Cell. 113. 357-367 (2003)
• [文献書誌] Takayama, Y., Sugino, A., Araki, H.et al.: "GINS, a novel multiprotein complex required for chromosomal DNA replication in budding yeast."Genes Dev. 17. 1153-1165 (2003)
• [文献書誌] Konishi, A., Yoneda, Y., Tsujimoto Y.et al.: "Involvement of histone H1.2 in apoptosis induced by DNA double-strand breaks."Cell. 114. 673-688 (2003)
• [文献書誌] Lee, S.J., Tsukihara, T., Yoneda, Y.et al.: "The structure of importin-b bound to SREBP-2 : Insights into nuclear transport of a transcription factor."Science. 302. 1571-1575 (2003)
• [文献書誌] Kondoh, H.et al.: "Distinct roles of SOX2, Pax6 and Maf transcription factors in the regulation of lens-specific δ1-crystallin enhancer"Genes to Cells. 7. 791-805 (2002)
• [文献書誌] Hamada, H.et al.: "Lefty inhibits Nodal signaling by interaction with a common receptor and by efficient diffusion"Genes to Cells. 7. 401-412 (2002)
• [文献書誌] Tanaka, K.et al.: "Mutations in the XPD gene in xeroderma pigmentosum group D cell strains : confirmation of genotype-phenotype correlation"Am J Med Genet.. 110. 248-252 (2002)
• [文献書誌] Sugino, A.et al.: "The DNA polymerase domain of Polε is required for rapid, efficient and highly accurate chromosomal DNA replication, telomere length maintenance, and normal cell senescence in Saccharomyces cerevisiae"J. Biol. Chem.. 277. 28099-28108 (2002)
• [文献書誌] Tsujimoto Y.et al.: "Activation of mitochondrial voltage-dependent anion channel by apro-apoptotic BH3-only protein Bim"Oncogene.. 25. 4944-4956 (2002)
• [文献書誌] Yoneda, Y.et al.: "Nucleocytoplasmic transport of proteins and poly (A)+RNA at the reconstitute Tpr-less nuclei in living mammalian cells"Genes to Cells. 7. 421-434 (2002)
• [文献書誌] Nishizaki, Y. et al.: "Identification of essential sequence motifs in the node/notochord enhancer of Foxa2(Hnf3b) gene that are conserved across vertebrate species"Mech. Dev.. 102. 57-66 (2001)
• [文献書誌] Kamachi, Y. et al.: "Pax6 and SOX2 form a co-DNA-binding partner complex that regulates initiation of lens development"Genes Dev.. 15. 1272-1286 (2001)
• [文献書誌] Sakai, Y. et al.: "CYP26/P45ORA, a retinoic acid-inactivating enzyme, is required for establishing an uneven distribution of retinoic acid alongthe anteroposterior axis within the mouse embyro"Genes & Dev.. 15. 213-225 (2001)
• [文献書誌] Yamamoto, M.et al.: "A transcription factor FoxH1/FAST mediates Nodal signaling during anterio-posterior patterning and node formation in the mouse"Genes & Dev.. 12. 1242-1256 (2001)
• [文献書誌] Murai, M. et al.: "Early postnatal ataxia and abnormal cerebellar development in mice lacking xeroderma pigmentosum group A and the Cockayne syndrome group B DNA repair genes"Proc. Nati. Acad. Sd., USA.. 98. 13379-13384 (2001)
• [文献書誌] Kamiuti, S.et al.: "Translocation of Cockayne syndrome group A protein to the nuclear matrix: possible relevance to transcription-coupled DNA repair"Proc. Natl. Acad. Sci., USA,. (in press).
• [文献書誌] Waga, S. et al.: "DNA Polymerase epsilon is required for co-ordinated, rapid and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts"Proc. Natl. Acad. Sci., USA,. 98. 4978-4983 (2001)
• [文献書誌] Kamimura, Y. et al.: "Sld3, which interacts with Cdc45 (SId4), functions for chromosomal DNA replication in Saccharomyces cerevisiae"EMBO J.. 20. 2097-2107 (2001)
• [文献書誌] Hata, S. et al.: "Vascular smooth muscle maintains the levels of Bcl-2 in endothelial cells"Atherosclerosis. 152. 309-316 (2001)
• [文献書誌] Shimizu, S. et al.: "Essential role of voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells"J.Cell Biol.. 152. 237-250 (2001)
• [文献書誌] Nagoshi, E. et al.: "Dimerization of the sterol regulatory element-binding protein-2 via the helix-loop-helix-leucine zipper domain is prerequisite for its nuclear localization mediated by importin b"Mol. Cell. Biol.. 21. 2779-2789 (2001)
• [文献書誌] Shimizu, S.et al.: "Essential role of voltage-dependent anion channel in various forms of apoptosis in mammalian cells"J.Cell Biol.. 152. 237-250 (2001)
• [文献書誌] Kurisaki, A. et al.: "Transforming growth factor-b induces nuclear import of Smad3 in an importin-b1 and Ran-dependent manner"Mol. Biol. Cell.. 12. 1079-1091 (2001)
• [文献書誌] Hieda, M. et al.: "Nuclear import of the U1 A splicesome protein is mediated by importin a/b and Ran in living mammalian cells"J.Biol. Biol.. 276. 16824-16832 (2001)
• [文献書誌] Kamachi,Y. et al.: "pairing SOX off with partners in regulation of embryonic development."Trends Genet.. 16. 182-187 (2000)
• [文献書誌] Sakai,Y. et al.: "CYP26/P450RA, a retinoic acid-inactivating enzyme, is required for establishing an uneven distribution of retinoic acid along the anteroposterior axis within the mouse embryo."Genes & Dev.. 15. 213-225 (2001)
• [文献書誌] Lee,S.J. et al.: "The adoption of a twisted structure of importin-bis essential for the protein-protein interaction required for nuclear transport."J.Mol.Biol.. 302. 251-264 (2000)
• [文献書誌] Nakatsu,Y. et al.: "XAB2, a novel tetratricopeptide repeat protein, involved in transcription-coupled DAN repair and transcription."J.Biol.Chem.. 275. 34931-34937 (2000)