| 研究課題/領域番号 |
13033008
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
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| 研究分担者 |
大河内 美奈 東京農工大学, 工学部, 助手 (70313301)
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| 研究期間 (年度) |
2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2001年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | シャペロニン / シャペロン / プレフォルディン / 古細菌 / 超好熱性菌 / フォールディング / X線結晶構造解析 / 酵母 / CCT / ストレス応答 / 結晶 |
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| 研究概要 |
我々は、超好熱性古細菌由来Group II型シャペロニン、プレフォルディンを用いて、構造学的にGroup II型シャペロニンのBuild-in Lid開閉機構及びシャペロニンとプレフォルディンの協調機構の解明を目的に研究を行っている。
様々なヌクレオチド存在下で、野生型αシャペロニンにproteinase Kを作用させたところ、ATP, AMP-PNP存在下では分解が妨げられた。また、アピカルドメインの先端にTrp残基を導入した変異体を作成し、構造変化をその蛍光特性から追跡した。その結果、ATP, AMP-PNPと結合したシャペロニンにおいて蛍光の増大が観測された。これらの結果は、ATPとの結合に伴い、Built-in Lidが閉じることを示唆するものだと思われる。一方、リフォールディング活性を示さない変異体αシャペロニンを用いた際には、この構造変化を示す結果は得られなかった。Built-in LidのDeletion Mutantを作成したところ、変性タンパク質結合能は有していたが、タンパク質フォールディング活性は失われていた。このDeletion Mutantの結晶を得ることに成功した。
プレフォルディンはWild型の結晶から良いDiffractionが得られないことから、βサブユニットのC末8残基欠失体の結晶化を試み20%PEG 4000、0.1M HEPES(pH7.7)の条件で結晶が得られた。しかし、この結晶からも構造解析に使える反射を得ることは出来なかった。シャペロニンとの共結晶の作成を試みたが結晶は得られていない。
また、酵母由来プレフォルディンの各サブユニットの発現系を作成し、全てのサブユニットを組み込んだ同時生産系を構築した。
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