翻訳反応の駆動部となるリボソーム機能部位の結晶構造解析

• 研究課題/領域番号: 13033015
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 内海 利男 信州大学, 繊維学部, 助教授 (50143764)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円); 2002年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2001年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: リボソーム / リボソームRNA / リボソームタンパク質 / GTPaseセンター / 高度好熱性細菌 / RNA-タンパク質相互作用 / L7 / L12 / L10 / RNA-蛋白質相互作用 / L11

研究概要

翻訳反応の駆動部となるリボソームGTPaseセンターを構成するタンパク質の構造と機能面の解析を、原核生物の高度好熱性細菌Thermus thermophilusと真核生物の蚕の両系を用いて行い、以下のような成果が得られた。
1.高度好熱性細菌タンパク質の分析
(1)GTPaseセンターを構成するタンパク質L7/L12, L10, L11をそれぞれ、大腸菌を用いて大量発現させ、精製した。
(2)rRNA断片を用いた結合分析により、得られたリボソームタンパク質が23S rRNAの1070領域に集合することを確認した。
(3)大腸菌リボソーム中の相同タンパク質と置換して、高いリボソーム機能を確認した。
(4)理化学研究所の横山グループとの共同研究で、タンパク質複合体の結晶化を試みている。
2.蚕タンパク質の分析
(1)原核L7/L12に対応する蚕P1とP2両タンパク質、およびL10とL11の相同体であるP0とeL12の大腸菌発現系を構築し、タンパク質精製法を確立した。
(2)分子間相互作用の分析により、P1-P2間結合性を検出し、これがP0との結合、およびP0のrRNAとの結合性を誘発することを明らかにした。この結果により、原核L7/L12ホモダイマーに対応するタンパク質が真核リボソームではP1-P2ヘテロダイマーであることが明らかにされた。
(3)蚕P0.P1-P2複合体とeL12は大腸菌リボソームの相同タンパク質と置換され、リボソーム上で真核伸長因子の受容生に関する機能を保持した。
(4)真核型GTPaseセンターの特徴となる、P1-P2ヘテロダイマーを大量に調製した。目下、結晶化を試みている。

研究成果

• [文献書誌] Shimizu, T., Uchiumi, T.et al.: "Interaction among silkworm ribosomal proteins P1, P2 and P0 required for functional protein binding to the GTPase-associated domain of 28S rRNA"Nucleic Acids Res.. 30. 2620-2627 (2002)
• [文献書誌] Uchiumi, T. et al.: "Translation elongation by a hybrid ribosome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coil ribosome are replaced with rat counterparts"J. Biol. Chem.. 277. 3857-3862 (2002)
• [文献書誌] Uchiumi, T. et al.: "Ribosomal proteins at the stalk region modulate functional rRNA structures in the GTPase center"J. Biol. Chem.. 277. 41401-41409 (2002)
• [文献書誌] Masuda, H., Uchiumi, T.et al.: "Effects of replacement of prolines with alanines on the catalytic activity and thermostability of inorganic pyrophosphatase from thermophilic bacterium PS-3"J. Biochem.. 131. 53-58 (2002)
• [文献書誌] Nomura, T., Uchiumi, T.et al.: "A point mutation in ribosomal protein L7/L12 reduces its ability to form a compact dimer structure and to assemble into the GTPase center"Biochemistry. (in press). (2003)
• [文献書誌] Uchiumi, T. et al.: "Translation elongation by a hybrid ribosome in which proteins at the GTPase center of the Eschenchia coli ribosome are replaced with rat counterparts"J. Biol. Chem.. 277. 3857-3862 (2002)
• [文献書誌] Shizawa, N. et al.: "Direct mutagenesis studies of the C-terminal fingerprint region of Bacillus subtilis Pyrophosphatase"Eur. J. Biochem.. 268. 5771-5775 (2001)